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TRAVAUX PRATIQUES DE BIOLOGIE DES LEVURES
colonies de levures ade2. Retour aux ouvrages

SOMMAIRE

 
AVANT-PROPOS

INTRODUCTION

CHAPITRE I
UNE INTRODUCTION AUX TECHNIQUES DE LA MICROBIOLOGIE
Approvisionnement, culture et conservation des levures

Introduction

1) Comment se procurer des levures

1-1 Isoler des levures de l’environnement

A partir de végétaux

A partir de drosophiles

A partir de fromages

1-2 Levures d’origine industrielle

Levures lyophilisées

Boulangeries

Pharmacies

1-3 Fournisseurs spécialisés

Institut Pasteur

Sordalab

Sigma

2) Une nécessité : le travail en asepsie

2-1 Règles générales

2-2 Stérilisation des milieux et du matériel

Autocuiseur

Four à microondes

Matériels à usage unique

3) Une approche élémentaire pour obtenir des colonies

4) Repiquage et isolement de colonies

4-1 Repiquage par stries d’épuisement

4-2 Isolement par dilutions en série et étalement

4-3 Technique des répliques

5) Mise en culture dans un milieu liquide et mesure de croissance par turbidimétrie

6) Conservation des souches

6-1 Sur gélose

6-2 En milieu liquide

6-3 Au congélateur

6-4 Envoyer des levures par la Poste
 
 

CHAPITRE 2
OBSERVER LES LEVURES AU MICROSCOPE
Techniques cytologiques, colorations, numération

Introduction

1) Etudier les levures au microscope optique

1-1 Observation vitale sans coloration

1-2 Observations vitales après coloration

Rouge neutre

Vert Janus

1-3 Coloration de frottis fixés

Lugol

Bleu de méthylène

Noir Soudan

Bleu de Nil

2) Mesures diverses sur les cellules

2-1 Dénombrement des cellules avec une lame à numération

2-2 Dimensions des cellules

3) Obtenir des protoplastes

4) Cycle biologique des levures

4-1 reproduction asexuée

Bourgeonnement

Fission

4-2 reproduction sexuée

Fécondation

Sporulation

Coloration des spores sur frottis

5) Etudier les levures au microscope électronique
 
 

CHAPITRE 3
EXPERIMENTER SUR LE METABOLISME ENERGETIQUE
Respiration, fermentation, contrôle métabolique

Introduction

Méthodes de mesure

1) Mesures sur la respiration

1-1 Précautions et informations

Lavage des levures

Effet Crabtree

Mutants RD

Efficacité des différents sucres

1-2 Mesures avec un microrespiromètre : IR et QR

1-3 Mesures avec une électrode de Clark

Effet de la concentration en substrat

Utilisation respiratoire de divers sucres par S.cerevisiae.

2) Mesures sur la fermentation alcoolique

2-1 Précautions et informations

Lavage des levures

Démarrage d’une fermentation

Précautions

2-2 Manipulation élémentaire

2-3 Comparaison de l’efficacité de différents sucres avec batterie de tubes à essai

2-4 Mesure de l’intensité de fermentation et caractérisation des produits formés.

Caractérisation du gaz produit

Caractérisation de l’éthanol

2-5 Mesure indirecte du volume de gaz dégagé. Effet de l’addition de phosphate.

2-6 Microrespiromètre. Influence de la température.

2-7 Expérimentation assistée par ordinateur

Cinétique de la fermentation (capteur de produits volatils)

Utilisation d’un pH mètre

3) Substrats et métabolisme : méthodes biochimiques

3-1 Détection de la fermentation d’un sucre par un indicateur de pH

Fermentation du maltose

Fermentation du galactose

3-2 Mise en évidence de la respiration par le triphényltétrazolium

3-3 Auxanogrammes

Méthode des disques

Galeries

3-4 Suivi de la consommation de glucose en aérobiose et en anaérobiose avec bandelettes enzymatiques et lecteur

3-5 Transformations métaboliques des sucres : chromatographie sur couche mince

4) Contrôle métabolique

4-1 Mise en évidence de l’effet Crabtree

4-2 Mise en évidence de l’effet Pasteur

4-3 Répression catabolique : manipulation élémentaire

4-4 Répression catabolique : métabolisme du galactose

4-5 Répression catabolique : métabolisme du maltose

5) Cytochromes : spectre d’absorption des cytochromes oxydés et réduits

6) Contenu en ATP de cellules cultivées en aérobiose et en anaérobiose

ANNEXE

Les voies métaboliques de la glycolyse anaérobie et de la respiration et leur contrôle.
 
 

CHAPITRE 4
EXPERIMENTER SUR LES ENZYMES ET AUTRES PROTEINES
Des biosynthèses actives

Introduction

1) Détermination du répertoire enzymatique et applications

1-1 Enzymes endogènes et enzymes exportées

1-2 Induction enzymatique

Maltase

Phosphatases

2) Enzymes exportées

2-1 Saccharase : mise en évidence d'une protéine exportée

2-2 Saccharase : cinétique enzymatique

2-3 Catalase

Manipulation élémentaire : mise en évidence de la catalase

Cinétique de la catalase avec une méthode simple

Cinétique de la catalase avec une électrode de Clark

Cinétique de la catalase par colorimétrie

2-4 Phosphatase acide

Mise en évidence de la sécrétion de phosphatase acide

Inhibition de la sécrétion par les phosphates

2-5 Mise en évidence d’une amylase

3) Enzymes intracellulaires

3-1 Maltase

3-2 Succinodéshydrogénase

3-3 Les enzymes de la fermentation : expérience de Büchner

4) Phéromones sexuelles

4-1 Mise en évidence de la sécrétion d’une phéromone sur milieu solide

4-2 Action d’une phéromone in vitro

ANNEXE

Flux de protéines dans les cellules de levures
 
 

CHAPITRE 5
EXPLORER LA GENETIQUE DES LEVURES
Un organisme modèle en génétique

Introduction

1) Complémentation fonctionnelle

1-1 Test de complémentation fonctionnelle ; dominance et récessivité

1-2 Utiliser la technique des répliques pour déterminer le type sexuel

2) Mutations spontanées

2-1 Mise en évidence de mutants " petite " par la morphologie des colonies

2-2 Mise en évidence de mutants " petite " par le triphényltétrazolium

3) Action du rayonnement ultraviolet sur l’ADN

3-1 Détermination de la DL50

3-2 Mutagenèse par les ultraviolets

3-3 Détermination de la nature des mutations obtenues

4) Interactions entre expression des gènes et environnement

4-1 Nécessité de l’aérobiose pour la synthèse du pigment

4-2 Répression de la biosynthèse de l’adénine par l’adénine

5) Manipulations sur l’ADN

5-1 Extraction de l’ADN génomique

5-2 Extraction de l’ADN plasmidique

5-3 Hydrolyse par enzymes de restriction et électrophorèse sur gel de l’ADN

5-4 Transformation

ANNEXE

Quelques données sur les chromosomes de levure
 
 

CHAPITRE 6
PREPARATION DES MILIEUX, REACTIFS ET SOLUTIONS
Formulaire

1) Milieux de culture

1-1 Préparation des boîtes de culture

1-2 Milieux complets

1-3 Milieu minimum

1-4 Milieu de sporulation

1-5 Milieu sélectif pour la respiration

1-6 Milieu pour l’étude du contrôle métabolique

2) Suppléments

2-1 Antibiotiques

2-2 Acides aminés et bases azotées

2-3 Préparation des rondelles de papier pour auxanogrammes

Sucres

Adénine

3) Colorants cytologiques

3-1 Bleu de méthylène

3-2 Bleu de Nil

3-3 Lugol

3-4 Noir Soudan

3-5 Rouge neutre pour coloration vitale

3-6 Safranine

3-7 Vert janus pour coloration vitale

3-8 Vert malachite

4) Solutions et réactifs divers

4-1 Indicateurs de pH pour révélation de la fermentation

Indicateur au pourpre de bromocrésol

Indicateur au bleu de bromothymol

4-2 Réactif pour la détection des alcools

4-3 Solution pour extraction de plasmides

4-4 Solution de révélation pour chromatographie des sucres

4-5 Solutions pour la transformation

4-6 Solutions pour obtenir des protoplastes

Prétraitement

Traitement

4-7 Solvant de développement pour chromatographie des sucres

4-8 Triphényl tétrazolium (détection de la respiration)

5) Tampons

5-1 Tampon phosphate

5-2 Tampon acide acétique-acétate de sodium
 
 

FOURNISSEURS

INDEX

BIBLIOGRAPHIE

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Tous droits réservés
D. Pol, 1998