Mise en évidence de vacuoles gazeuses intracellulaires chez l'archéobactérie halophile Halobacterium salinarum

Autres activités et protocoles avec H. salinarum :
  • Introduction


Halobacterium salinarum
est un microorganisme fondamentalement aérobie, même s'il dispose de voies métaboliques alternatives (phototrophie, respiration anaérobie, fermentation) lui permettant de s'adapter aux modifications des conditions de l'environnement extrême dans lequel il prospère. Les cellules possèdent un cycle de Krebs à localisation cytoplasmique et une chaîne de transport des électrons située dans la membrane plasmique comportant divers cytochromes et autres molécules de transport des électrons. Une extrême concentration en sel et la température élevée des eaux dans lesquelle vit H. salinarum sont des facteurs qui diminuent fortement la solubilité de l’oxygène moléculaire dans l’eau et, généralement, c'est surtout la couche superficielle des eaux en contact avec l'air qui est oxygénée. Les cellules sont munies d'un dispositif remarquable qui existe aussi chez de nombreuses cyanobactéries. Il s'agit
de vacuoles gazeuses intracellulaires limitées par une couche de protéines, leur permettant de remonter mécaniquement vers la surface, là où la concentration en dioxygène dissous est la plus élevée et où davantage de lumière est disponible. Ce mécanisme ne dépense pas d'énergie, contrairement à la nage à l'aide des flagelles. Ces vacuoles pourraient aussi jouer un rôle dans la répartition verticale de la population.
Les vacuoles gazeuses de H. salinarum sont des structures creuses en forme de fuseau
ou de cylindre mesurant de 150 à 250 nm de long, limitées par une membrane d'environ 2 nm d'épaisseur constituée uniquement de protéines. 
Une douzaine de gènes codant les protéines des vésicules sont réunis ensemble sur un grand plasmide, appelé pNRC100. Il s'agit de gènes dont l'expression est induite par des conditions telles que l'absence d'oxygène dissous. Les mutations spontanées s'y produisent avec une fréquence élevée (voir la page Isolement de mutants spontanés).

Il est possible d'observer en culture l'effet des vacuoles gazeuses et de les mettre indirectement en évidence expérimentalement.

  • Observations
Pour observer les conséquences de la présence de vacuoles gazeuses intracellulaires, il est nécessaire de disposer d'une culture en milieu liquide complet. Si l'on veut démontrer expérimentalement l'existence de ces vésicules, il faut préparer un volume de culture suffisant pour pouvoir remplir quelques tubes à essai. Il faut donc ensemencer un volume suffisant, par exemple 50 mL.
Attention, à température ambiante, la croissance de la population bactérienne est assez lente (quelques jours) et il faut donc préparer la culture suffisamment à l'avance. Si l'on place les cultures dans une étuve (42°C maximum), la croissance sera plus rapide.
Dans tous les cas, une croissance optimale est obtenue en oxygénant correctement la culture en plaçant un barreau aimanté dans le flacon posé sur un agitateur rotatif avec une vitesse moyenne de rotation.
Après une semaine de culture l'agitation est stoppée de façon à laisser les cellules en suspension dans le milieu remonter en surface. Il faut environ deux jours pour que la majorité des cellules atteignent la surface où elles forment alors une couche épaisse comme on peut l'observer ci-dessous :


Culture de H. salinarum en milieu liquide deux jours après arrêt de l'agitation
Noter la couche épaisse de cellules remontées en surface en raison de la présence des vacuoles gazeuses intracellulaires

Si un échantillon de la culture est versé dans un tube à essai, la remontée des cellules vers la surface, qui demande un ou deux jours au minimum, est encore plus spectaculaire :


Deux échantillons d'une culture de H. salinarum abandonnés quelques jours dans des tubes à essai
Noter la densité élevée de cellules près de la surface et leur quasi-absence dans la parti inférieure des tubes

  • Mise en évidence expérimentale des vacuoles gazeuses

La première démonstration de la présence de vacuoles gazeuses incluses dans le cytoplasme de microorganismes a été faite en 1895 par trois microbiologistes allemands, Ahlborn, Klebahn et Strodtmann, qui montrèrent par l'expérience, désormais classique, dite "expérience du marteau, du bouchon et de la bouteille", que les cyanobactéries sont munies de tels dispositifs leur permettant de flotter. En appliquant, par un coup de marteau, une pression modérée à une culture remplissant entièrement un flacon fermé par un bouchon de liège, les vacuoles se dégonflent et les cellules qui flottaient initialement finissent par tomber au fond du flacon.
La même expérience peut être menée avec une culture de H. salinarum, démontrant ainsi que leur flottabilité est liée à la présence de vacuoles gazeuses.

Pour cela, il convient de verser un échantillon d'une culture en milieu liquide (suffisamment concentrée pour que l'effet soit bien visible) dans un tube et d'attendre quelques jours que la majorité des cellules flottent, comme on le voit sur le cliché 1 ci-contre.
Dans un second temps, la culture est versée par précaution dans un tube en plastique et ce dernier est muni d'un bouchon adapté de façon à ce qu'il puisse s'enfoncer jusqu'à la surface du liquide (cliché 2).
Un coup sec est alors appliqué sur le bouchon avec un marteau de façon à créer une surpression sur la culture. Le même résultat peut être obtenu par une simple centrifugation à vitesse modérée qui provoque également une surpression. Attention, une centrifugation trop rapide détruit les cellules.
Le tube est ensuite abandonné pendant quelques jours, enveloppé de papier d'aluminium pour éviter l'effet de la lumière, car H. salinarum est doué de phototropisme.
Quelques jours plus tard, le tube est examiné pour observer le résultat (cliché 3).

Comme on le constate, les bactéries sont rassemblées dans la partie inférieure du tube car, une fois les vacuoles vidées de leur gaz par la surpression, la gravité les fait tomber au fond du tube. Cependant, il n'y a pas de véritable sédimentation, contrairement à ce que l'on peut observer, par exemple, avec une suspension de levures abandonnée quelques jours, car les cellules de H. salinarum sont munies de flagelles qui leur permettent de nager dans le milieu.




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Didier Pol © 2007 

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