Observations au microscope optique de l'archéobactérie halophile Halobacterium salinarum


Autres activités et protocoles avec H. salinarum :


Introduction

Les cellules de Halobacterium salinarum sont, comme celles de toutes les bactéries, de petite taille, mais il est néanmoins possible de les observer au microscope si l'on dispose
au minimum d'un objectif  X 60.
Les cellules de H. salinarum ont généralement la forme de bâtonnets de 2 à 6 µm de long et de 0,4 à 0,7 µm de diamètre, mais elles présentent parfois une forme arrondie. Elles sont munies de flagelles implantés à une ou aux deux extrémités et peuvent ainsi se déplacer en fonction de la présence de telle ou telle substance chimique (chimiotropisme positif pour les acides aminés, petits peptides, oxygène dissous) ou de différentes longueurs d'onde de la lumière (phototropisme, négatif du bleu à l'ultraviolet, positif du rouge au vert). Les cellules sont limitées par une membrane formée de lipides, typiques des archées, et de protéines. Elles sont dépourvues de paroi mais enveloppées par une pellicule extramembranaire, appelée couche S, formée uniquement de glycoprotéines reliées par des ions Mg2+. La couche S maintient la forme en bâtonnet des cellules, semble-t-il, et les changements de forme des cellules pourraient être liés à des modifications ou à la destruction de cette couche. Lorsqu'elle est détruite, par exemple quand on colore un frottis sans précautions, les cellules prennent une forme arrondie.

Observations à l'état frais

Observation d'une goutte de culture liquide

Après avoir déposé une goutte de culture sur une lame, recouvrir d'une lamelle et déposer la préparation sur la platine du microscope.
Noter qu'il est préférable de mettre un petit volume de culture de façon à ce que la couche de liquide soit la plus fine possible pour limiter les mouvement verticaux des cellules car, aux grossissements 600 fois et supérieurs, la profondeur de champ du microscope est faible.
Avec l'évaporation, les bords de la lamelle se recouvrent progressivement de sel qui cristallise, ce qui lute automatiquement la lamelle et ralentit considérablement l'évaporation.
Observer la préparation à un grossissement minimal de 600 fois. Si on ne peut guère voir les détails de la structure cellulaire, on peut cependant constater la forme de bacille de la plupart des cellules, la forme arrondie de quelques autres et, parfois, des figures de division. Le cliché ci-dessous correspond à l'ensemble du champ visible au microscope à un grossissement de 630 fois tel qu'il est capturé par l'appareil photo, mais il a été redimensionné (15 % de la dimension originale) pour permettre son affichage.


Cellules de H. salinarum (microscope optique X 630, état frais)

Le cliché ci-dessous a subi un redimensionnement moins important (21 % de la dimension originale) de façon à ce que les cellules soient mieux visibles :


Cellules de H. salinarum (microscope optique X 630, état frais)

Enfin, l'image ci-dessous est une partie limitée du cliché original :


Cellules de H. salinarum (microscope optique X 630, état frais)

On peut aussi observer les cellules avec un objectif 100 à immersion. L'affichage des images obéit à la même logique que pour les clichés précédents :


Cellules de H. salinarum (microscope optique X 1 000, objectif à immersion, état frais).
Image redimensionnée


Cellules de H. salinarum (microscope optique X 1 000, objectif à immersion, état frais)
Partie de l'image (redimensionnée)


Cellules de H. salinarum (microscope optique X 1 000, objectif à immersion, état frais)
Partie de l'image non redimensionnée

Dans une telle préparation, les cellules restent vivantes pendant plusieurs jours comme on peut le constater par leurs mouvements. Ces derniers sont visibles sur une vidéo que vous pouvez visionner en ligne ou télécharger en cliquant sur l'image ci-dessous (soyez patients, fichier de 16 Mo) :


Après avoir cliqué sur l'image, un menu s'affiche sur votre écran.

  • Pour visualiser la vidéo, cocher "ouvrir avec" (Choisir Real player, Windows media player, etc.) et cliquer sur le bouton "OK".
  • Pour enregistrer la vidéo sur votre disque dur, cliquer sur le bouton "Enregistrer sur le disque" puis choisissez l'emplacement de sauvegarde à partir duquel vous pourrez ouvrir la vidéo.
 Colorations

Les halobactéries étant détruites par le contact avec une solution insuffisamment concentrée en sels, il a fallu mettre au point une méthode permettant de contourner ce problème. Dès 1955, une méthode de coloration spécifique a été développée par H. P. Dussault. La méthode indiquée ici s'en inspire directement. Elle consiste à étaler en couche mince sur une lame porte-objet, soit une goutte d'une suspension épaisse obtenue directement à partir d'une culture en milieu liquide, soit une goutte d'une suspension obtenue en agitant vigoureusement, dans une solution de sel à 20 %, des colonies obtenues sur milieu solide.
La préparation est ensuite abandonnée à l'air jusqu'à ce qu'elle ait séché et que le sel ait cristallisé.
La lame est alors plongée dans l'acide acétique à 2 % pendant 5 minutes, ce qui a pour effet de fixer les cellules et de dissoudre le sel simultanément.
Après avoir été retirée du bain d'acide acétique, la préparation est laissée à sécher à l'air.
Une fois sèche, elle est recouverte d'une solution de violet cristal à 0,25 % ou de bleu de méthylène à 2 % pendant 3 minutes. Alternativement, il est également possible de réaliser à ce stade une coloration de Gram en utilisant de la fuschine basique comme contre colorant.
Après élimination du colorant, la lame est lavée à l'eau distillée puis laissée à sécher. Elle peut alors être observée directement au microscope, mais si l'on utilise un objectif à immersion, il convient de recouvrir la préparation avec une lamelle.
Les clichés suivants présentent des exemples de résultats.


Cellules de H. salinarum (microscope optique X 630, coloration par le bleu de méthylène).
Image redimensionnée


Cellules de H. salinarum (microscope optique X 630, coloration par le bleu de méthylène)
Partie de l'image non redimensionnée


Cellules de H. salinarum (microscope optique X 1 000, objectif à immersion, coloration par le bleu de méthylène).
Image redimensionnée


Cellules de H. salinarum (microscope optique X 1 000, objectif à immersion, coloration par le bleu de méthylène).
Partie de l'image non redimensionnée

Observations au microscope polarisant

Si l'on dispose d'un microscope polarisant, il est intéressant d'en profiter pour observer des cristaux de sel.
Il suffit de faire un frottis à partir d'une culture dense et de le laisser s'évaporer jusqu'à cristallisation du sel et séchage. Cette préparation pourra encore être utilisée après l'observation au microscope polarisant pour mettre en oeuvre l'une des colorations précédentes.
Une fois sèche, la lame est couverte de cristaux de sel qui peuvent être observés à des grossissements variés. Toutefois, les bactéries ne sont visibles individuellement qu'avec un grossissement de l'ordre de 600.



Cristal de sel observé avec deux orientations différentes des filtres polarisants (microscope polarisant X 100)
Noter le changement des couleurs selon la position des filtres indiquant une organisation cristalline ainsi que les amas sombres formés par les bactéries à la surface du cristal.

Détail d'un amas de bactéries à la surface d'un cristal de sel (microscope optique X 630)

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Didier Pol © 2007

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