Fiche technique
Fermentation alcoolique chez la levure : méthode de
mesure
et caractérisation des produits formés




  • Introduction

Si toutes les levures respirent, à l'exception des mutants déficients respiratoires (ceux donnant des colonies "petites"), elles ne sont pas toutes capables de fermenter, même si la fermentation alcoolique existe chez la majorité d'entre elles, notamment chez les espèces couramment utilisés dans l’enseignement comme les Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Schwanniomyces, Candida.

La fermentation étant, sur le plan énergétique, moins rentable que la respiration, il faut en moyenne 4 g de glucose pour obtenir 1 g de levures par respiration alors qu'il faut environ 100 g de glucose pour obtenir le même résultat par fermentation. Aussi, les levures qui fermentent consomment beaucoup plus de substrat par unité de temps pour assurer leur croissance que celles qui respirent. En culture sur milieu solide, la différence de rendement se traduit par des colonies de plus petite taille.

Dans cette méthode, les levures fermentent dans un flacon étanche relié par un tube à un autre flacon étanche rempli d'eau. Ce dernier comporte aussi une tubulure de vidange se déversant dans une éprouvette graduée. La production de dioxyde de carbone par la fermentation produit une surpression dans le tube d'eau ce qui fait sortir l'eau par le tube de vidange. La mesure du volume d'eau recueillie dans l'éprouvette graduée permet de quantifier l'activité de fermentation.
La méthode présentée, simple et précise, peut être utilisée dans de nombreuses expériences quantitatives : influence de la concentration en substrat (glucose, saccharose, galactose), de la température, du pH, comparaison de l’efficacité de différents sucres, influence de l'addition de phosphates, de vitamines, etc.

  •  Précautions et informations
    • Lavage des levures

La levure d’origine industrielle comme la levure de boulangerie est conditionnée en pâte ou lyophilisée à partir de cultures menées dans un milieu riche. En conséquence, des substrats sont souvent présents dans ces préparations et les levures mises en suspension dans l’eau fermentent spontanément.
Dans ces conditions, il est difficile voire impossible de mener des mesures fiables et, avant toute expérience comportant des mesures sur le métabolisme énergétique, il est nécessaire de laver soigneusement les levures pour éliminer toute trace de substrat dans le milieu.
Protocole de lavage
1- Centrifuger la suspension et éliminer le surnageant.
2- Remettre les cellules en suspension dans de l'eau en agitant suffisamment.
3- Recommencer et mettre les levures en suspension dans le milieu désiré.
Le lavage d’une suspension de levures peut être aussi réalisé par épuisement des restes de substrat disponible en faisant buller de l’air ou en agitant la suspension sur agitateur magnétique pendant quelques heures.
Si l’on ne dispose pas de centrifugeuse, on peut remplacer la centrifugation par une filtration.
    • Démarrage d’une fermentation 
L'oxygène favorise la synthèse de certaines molécules notamment lipidiques nécessaires pour la respiration comme pour la fermentation. Aussi, on aura intérêt à démarrer une culture par une période d'aérobiose même lorsque l'on désire étudier la fermentation car la fermentation sera alors plus efficace.
    • Précautions
Ne pas mener de fermentation dans un flacon étanche et ne pas remplir entièrement le flacon : il y a risque d'éclatement dans le premier cas et de débordement dans le second.

L’oxygène inhibe la fermentation chez certaines espèces (effet Pasteur). Il faut donc éviter d'agiter trop fortement le flacon, mais une agitation lente est utile pour limiter la sédimentation des levures et faciliter leur accés aux substrats.

  • Protocole

1- Mettre en suspension 5 g de levures dans 100 mL d’eau distillée dans un flacon de volume un peu supérieur (150 mL au minimum).
2- Mettre le flacon au bain-marie à 30°C et y faire buller de l’air avec un aérateur d’aquarium pendant une quinzaine de minutes.
3- Arrêter l’aération.
4- Verser 4 g de glucose ou 2 g de saccharose dans le flacon et agiter jusqu’à dissolution complète du sucre.
5- Connecter tuyaux et bouchons selon l'un des deux montages ci-dessous et fermer hermétiquement les bouchons.
6- Laisser le robinet ouvert pendant une quinzaine de minutes.
7- Fermer le robinet et relever à intervalles réguliers pendant une vingtaine de minutes, soit le volume de gaz dans l'éprouvette initialement remplie d'eau et retournée sur la cuve à eau (montage 1), soit le volume d’eau émis dans l’éprouvette de mesure (montage 2) .

Dispositif de mesure du CO2 produit permettant la collecte du gaz (montage 1)
Dispositif de mesure : lecture du volume d'eau déplacé par le CO2 produit (montage 2)

Utiliser un bain à température constante (maximum autour de 30°C) et une solution tampon pour les levures comme pour la dissolution des substrats sauf si l’on se propose de suivre les variations de pH.

Si l’on désire mener une fermentation de longue durée, une source d'azote et de l'extrait de levures (vitamines) sont indispensables dans le milieu de culture et il est fortement conseillé de travailler en milieu stérile ou d'utiliser des antibiotiques pour prévenir la croissance de bactéries. Pour des manipulations de durée brève, ces précautions ne sont pas nécessaires.

    • Caractérisation du gaz produit
Remplacer l'eau du flacon de réception avec de l’eau de chaux ou de l’eau de baryte (obtenues en dissolvant l’hydroxyde de calcium ou de baryum dans l’eau distillée jusqu’à saturation).
Le précipité de carbonate de calcium ou de baryum montre que le gaz produit est du dioxyde de carbone.
    • Mise en évidence de l’éthanol
1- Prélever 10 mL du milieu de fermentation après décantation des cellules ou après centrifugation.
2- Verser le prélèvement dans un tube à essai contenant 10 mL de réactif pour la détection des alcools.
3- Le virage du réactif au bleu violet caractérise la présence d’alcool.

Réactif des alcools

Dissoudre 5 g de bichromate de potassium dans 100 mL d’acide nitrique concentré.
Attention : produits dangereux à manipuler sous hotte en portant des lunettes


RETOUR AU SOMMAIRE
TOUS DROITS RÉSERVÉS
Didier Pol © 2006 
dpol#noos.fr
Emplacements des visiteurs de cette page

N'hésitez pas à faire connaître vos impressions, commentaires, suggestions etc