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ACTIVITES SCIENTIFIQUES ET OUTILS INFORMATIQUES : ENZYMOLOGIE
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Réalisation et suivi par ExAO de réactions enzymatiques in vitro
      • Deuxième séance :
Mesure de la vitesse de réaction et effet de la concentration en substrat sur la vitesse de réaction
      • Troisième séance :
Approche des interactions enzyme-substrat par modélisation moléculaire sur ordinateur
      • Quatrième séance :
Exercice pratique : cinétique d'une réaction enzymatique dans différentes conditions.



Présentation
Introduction

Les travaux menés sur les protéines en général et sur les enzymes en particulier sont d’une importance cruciale pour la compréhension du vivant et leur étude pratique peut aisément être menée au lycée (1, 2). La somme de connaissances accumulées depuis un siècle et demi dans ce domaine est impressionnante. Ainsi, la série de publications " Methods in enzymology "comporte aujourd’hui plus de deux cent soixante dix volumes représentant plusieurs dizaines de milliers de pages.
Outils universels des cellules et interface entre génotype et phénotype, les enzymes ont fait l’objet de recherches intensives ayant permis de dévoiler les principes du fonctionnement cellulaire. Leur importance s’est encore accrue avec le lancement de projets de séquençage des génomes à grande échelle. De plus, leur intérêt va bien au delà de la seule quête de connaissances fondamentales puisqu’elles trouvent des applications dans des domaines variés tant biomédical (réactifs, kits de diagnostic, méthodes thérapeutiques) qu’industriel (mise en œuvre de technologies à base d’enzymes dans l’industrie agro-alimentaire et dans celle de la pâte à papier par exemple). Un domaine d’une telle importance scientifique, médicale et économique se doit donc d’être abordé en profondeur au lycée, notamment dans la filière scientifique. Aussi, dans les programmes de sciences de la vie et de la Terre (SVT) des lycées, un chapitre du programme de première S est consacré précisément à l’étude des enzymes (3). En outre, les élèves sont continuellement confrontés à ces extraordinaires biocatalyseurs protéiques au cours de leurs études puisqu’ils assurent la quasi totalité des fonctions cellulaires.

Si l’on se limite aux chapitres du programme qui leur sont dédiés en première S, dans la première partie Matière, énergie et information génétique à l’échelle de l’organisme, les contenus mentionnent Les enzymes, agents de catalyse comme tête de chapitre. Les objectifs cognitifs précisent :

  • L’équipement enzymatique d’une cellule conditionne les réactions qu’y s’y produisent.
  • Toutes les enzymes sont des catalyseurs biologiques :
    • elles augmentent la vitesse des réactions chimiques sans subir elles-mêmes de modification ;
    • elles n’agissent que dans certaines conditions de température et de pH ;
    • elles sont spécifiques d’un substrat, molécule dont elles catalysent la transformation ;
    • elles sont spécifiques d’un seul type de réaction.
  • Leur fonction est liée à leur structure. La complémentarité entre une zone de la molécule enzymatique - le site actif - et une zone correspondante de la molécule de substrat permet la formation du complexe enzyme - substrat, étape indispensable à la réalisation de la réaction.
Comme on peut le constater, les principes essentiels des structures et des fonctions des protéines enzymatiques sont explicitement cités par le programme. Compte tenu de ces exigences, de quels moyens disposent les enseignants pour atteindre les objectifs du programme ?

Activités pratiques en enzymologie

En première S, l’enseignement de SVT comporte une plage horaire hebdomadaire de 90 minutes réservée aux travaux pratiques (TP). De cette façon, l’investigation des problèmes biologiques peut se réaliser de façon concrète à l’aide de véritables activités scientifiques mettant à profit les ressources des laboratoires de SVT. En mobilisant aussi bien les connaissances que les savoir-faire techniques, les séances de TP constituent une véritable initiation aux méthodes scientifiques, notamment expérimentales. Les activités pratiques proposées par le programme de première S dans le domaine de l’enzymologie comportent des cultures de souches bactériennes, l’étude expérimentale de la catalyse enzymatique et des mesures de cinétique enzymatique.

En première S, à la fin du premier trimestre, les élèves se sont familiarisés avec quelques aspects de biochimie et sont au fait, depuis la classe de troisième de l’existence des enzymes. Ils ont aussi rencontré les enzymes à diverses occasions et, le plus souvent, utilisé des réactions enzymatiques en TP. Pour des raisons diverses, la classe de première S est celle dans laquelle les séances de TP sont les plus nombreuses. Les établissements disposent, en majorité, de matériel de laboratoire permettant de mener à bien des TP variés et l’utilisation des outils informatiques se développe rapidement. Ainsi, en dehors des activités que l’on pourrait qualifier de " classiques " et qui sont en effet pratiquées dans de nombreux lycées, les nouveaux outils désormais disponibles, souvent d’une grande puissance, rendent possible toute une gamme d’activités scientifiques nouvelles. Outre l’ExAO, aujourd’hui bien implantée, des logiciels variés réalisent des opérations autrefois réservées aux chercheurs spécialisés équipés de matériel " haut de gamme " : traitement de séquences de molécules informatives, modélisation moléculaire tridimensionnelle, simulations etc. De nombreux établissements disposent de ces outils et les utilisent (4). C’est la raison pour laquelle nous avons élaboré une progression sur les enzymes en privilégiant la diversité des activités scientifiques des élèves et l’utilisation des outils informatiques dans le but d’évaluer leur apport éventuel à la formation scientifique des élèves.

Pour atteindre les objectifs prévus par le programme, quatre à cinq séances de travaux pratiques de 90 minutes ont été prévues dont la dernière est réservée à l’évaluation. La synthèse des résultats expérimentaux obtenus par les élèves au cours des TP, l’apport d’informations complémentaires qui ne peuvent être obtenues lors des expérimentations réalisées par les élèves et les explications nécessaires à la compréhension de la démarche suivie prennent place pendant les cours entre les séances de TP. Leur contenu sera brièvement indiqué dans la progression mais ne sera pas détaillé.

Matériels disponibles pour l’expérimentation

Dans l’établissement où s'est déroulée l’expérimentation, une salle d'ExAO comportait huit postes équipés d’un ordinateur (486 DX 66, 8 MO de mémoire vive) et d’une interface d’acquisition ORPHY GTS (Micrelec) avec une imprimante pour quatre machines. Une seconde salle, utilisée pour la modélisation moléculaire, comportait quatorze ordinateurs en réseau (Pentium 133, 32 MO) avec écran 17 pouces. L’environnement matériel ne constituait donc pas un facteur limitant.

Logiciels

Pour les expériences d’enzymologie, les interfaces étaient pilotées par le logiciel REGRESSI (Micrelec). C’est un logiciel d’acquisition - tableur généraliste. Il permet de déterminer les voies et les paramètres d’acquisition de l’interface et d’effectuer divers traitements sur les données. Les paramètres d’acquisition utilisés au cours des expériences présentées sont indiqués dans les protocoles liés aux fiches de TP. Le logiciel était connu de nombreux élèves de première S de l’établissement qui l’avaient utilisé en physique ou en option sciences expérimentales.

Le logiciel RASMOL est un logiciel de modélisation tridimensionnelle des molécules biologiques à partir de leurs coordonnées atomiques au format pdb (protein data bank) disponibles dans les banques de données moléculaires. Il autorise divers traitements et manipulations sur les molécules affichées à l’écran (5). Il peut être chargé sur le site BIO-GEO de l'INRP avec une banque de données adaptée.

Annexes

Le texte ci-dessous détaille la progression pédagogique proposée en explicitant le contenu des fiches de TP remises aux élèves. Il est complété par quelques exemples de résultats obtenus par des élèves. Les fiches distribuées aux élèves en début de séance qui comportent les procédures à suivre et des questions de travail sont accessibles à la rubrique FICHES DE TP de ce site.  Dans la phase d’élaboration des protocoles, il n’est demandé aux élèves que les principes des procédures à mettre en oeuvre. Un protocole détaillé leur est ensuite distribué pour la mise en œuvre pratique.

Les matériels, les enzymes et les autres produits utilisés ont été achetés auprès de fournisseurs spécialisés (Matériel d’ExAO : MICRELEC ; produits chimiques : SIGMA).


Progression pédagogique

Première séance :

REALISATION ET SUIVI PAR EXAO DE REACTIONS ENZYMATIQUES IN VITRO

Le but de la séance est de permettre aux élèves de se familiariser avec le matériel et de concevoir un protocole expérimental permettant de mettre en évidence la fonction catalytique des enzymes.

Cette séance comporte plusieurs postes différents de façon à faire travailler les différents groupes d’élèves sur des réactions enzymatiques différentes utilisant des méthodes de mesure différentes.

Objectifs méthodologiques

Prise en main du matériel et réalisation d’un protocole expérimental.

Objectifs cognitifs

Mise en évidence chez les enzymes étudiées de propriétés de catalyseurs et suivi de la réaction enzymatique, par mesure de la disparition d’un substrat ou de l’apparition d’un produit dans le milieu réactionnel.

On considère comme acquis les principes de la constitution chimique des protéines, de leur biosynthèse, de leur codage par les gènes, le fait que les enzymes sont des protéines et que des cellules spécialisées diffèrent par leur répertoire enzymatique.

Problème

Comment étudier une réaction enzymatique ?

Les équations-bilan des quatre réactions étudiées sont données sur une fiche comportant également des consignes pratiques et des questions de travail (rappelées ci-dessous en italiques). Pour cette séance, les postes d’ExAO sont montés à l’avance. Chaque groupe d’élève choisira son poste selon l’enzyme qui lui sera confiée.

Quatre postes sont prévus correspondant à trois oxydoréductases. Les équations-bilan des réactions biochimiques correspondantes sont indiquées ci-dessous.

1) Réduction du peroxyde d’hydrogène par le gaïacol (peroxydase, EC 1.11.1.7)

H2O2 + RH2 (gaïacol incolore) ® 2 H2O + R (gaïaquinone colorée)

2) Dismutation du peroxyde d’hydrogène (catalase, EC 1.11.1.6)

2 H2O2 ® 2 H2O + O2

3) Oxydation du pyrocatéchol par le dioxygène (tyrosinase, EC 1.14.18.1)

Dihydroxybenzène (incolore) + ½ O2 ® benzoquinone (colorée) + H2O

4) Oxydation du glucose par le dioxygène (glucose oxydase, EC 1.1.3.4)

Glucose + O2 + H2O ® Gluconolactone + H2O2

Après une brève présentation des réactions étudiées, de leur rôle métabolique et de la nécessité de réaliser des réactions enzymatiques in vitro pour étudier les enzymes, une première question est posée :

  • Quel(s) paramètre(s) peut-on mesurer pour suivre l’évolution de chaque réaction chimique au cours du temps sachant que l’on dispose de postes équipés pour la colorimétrie et pour l’oxymétrie ?
Une fois réalisée l’adéquation entre réaction à suivre et paramètre à mesurer il est demandé de formuler une hypothèse sur les variations de ce paramètre au cours du temps :
  • Connaissant l’équation-bilan de la réaction, quels résultats s’attend-on à observer lorsque la réaction a lieu ? Lorsqu’elle n’a pas lieu ?
Pour caractériser la fonction catalytique des enzymes, il est demandé aux élèves de proposer un protocole permettant de mettre en évidence l’action de l’enzyme. Ils disposent de la chaîne d’acquisition et des solutions nécessaires (substrat, enzyme, tampon).
  • Proposez un protocole permettant de mettre en évidence une action de l’enzyme sur la vitesse de réaction.
On attend le principe d’une comparaison de l’évolution de la réaction en absence et en présence d’enzyme.
  • Une fois accepté par le professeur, réalisez votre protocole, sauvez les résultats et analysez le graphique obtenu.
Une discussion éventuelle peut s’instaurer concernant la durée d’acquisition mais les enzymes ont été choisies pour obtenir des résultats en quelques minutes ce qui permet de répéter les mesures, nécessité à la fois scientifique et pédagogique.

A l’issue de cette expérience, on constate donc l’absence de réaction en absence d’enzyme alors qu’une réaction rapide est détectable en sa présence. On est amené à identifier trois parties sur le tracé qui illustrent l’évolution de la vitesse de réaction. Appréciée quantitativement par la disparition du substrat ou l’apparition du produit par unité de temps, la vitesse est d’abord constante (vitesse initiale) puis elle diminue progressivement avant de tendre vers zéro. Les colorimètres donnant des valeurs en transmission, un bref rappel est donné sur l’absorbance pour justifier la nécessité de calculer cette nouvelle variable. On explique l’intérêt de la mesure de la vitesse dans la partie linéaire du tracé (pente). Certains élèves ont déjà rencontré ces notions en option sciences expérimentales.

  • Les résultats obtenus sont-ils suffisants pour affirmer que les enzymes sont des biocatalyseurs ? Justifier.
On attend ici la reconnaissance de l’absence de preuve que l’enzyme se retrouve inchangée en fin de réaction.

Une séance de cours est ensuite utilisée pour faire la synthèse des résultats (une enzyme est un biocatalyseur de nature protéique) et poser les nouveaux problèmes.

Maintenant que l’on dispose d’une méthode de suivi des réactions enzymatiques, on se propose de l’utiliser pour rechercher comment enzyme et substrat interagissent. Pour cela, des mesures sont nécessaires car l’activité d’une enzyme vis à vis de ses substrats peut être analysée en termes de cinétique chimique. C’est l’objet de la séance suivante.

Résultats élèves séance 1


Deuxième séance :

MESURE DE LA VITESSE DE REACTION ET EFFET DE LA CONCENTRATION EN SUBSTRAT SUR LA VITESSE DE REACTION

Objectifs méthodologiques

Mise au point d’un protocole expérimental et analyse des résultats.

Objectifs cognitifs

Caractéristiques d’une cinétique de saturation, association enzyme-ligand, notion de complexe enzyme-substrat.

Un nouveau problème est posé pour la résolution duquel vont être utilisés les outils pris en main lors de la séance précédente.

Problème

Comment se réalisent les interactions entre enzyme et substrats responsables de l’activité d’une enzyme ?

On reprend comme base de départ le tracé de la cinétique réactionnelle en fonction du temps obtenu à la séance précédente et la notion de vitesse initiale, paramètre caractéristique de l’activité de l’enzyme, calculé à partir des résultats expérimentaux.

  • Rappeler le principe de la mesure de la vitesse initiale et expliquer en quoi mais avec quelles limitations elle permet de caractériser l’activité de l’enzyme, c’est à dire l’efficacité avec laquelle le substrat est transformé en produit ?
On attend le principe de la mesure par la pente de la partie linéaire initiale du tracé ainsi que la mise en relation de la vitesse, maximale et constante en début de réaction, avec le maximum d’efficacité de transformation des substrats dans les conditions de l’expérience. Des remarques sur le fait que les mesures ont été faites avec une seule concentration d’enzyme et de substrat et sur l’effet de la température sont attendues.

On se propose maintenant d’étudier l’interaction entre l’enzyme et le substrat en faisant varier la concentration en substrat.

  • Sachant que le substrat est consommé au cours de la réaction mais que l’enzyme reste inchangée, quel effet peut-on attendre d’une diminution de la concentration en substrat sur la vitesse initiale de réaction ? Justifier.
  • Elaborer un protocole expérimental permettant de tester l’effet des variations de concentration en substrat sur la vitesse de réaction.
  • Après acceptation du protocole par le professeur, le réaliser. Sauver les données et construire un nouveau graphique représentant Vi = f [S] à partir des mesures.
Réalisation du protocole

Les différentes concentrations en substrat doivent être obtenues par dilution d’une solution-mère de concentration imposée par le professeur (calculée pour obtenir la vitesse maximale avec la concentration d’enzyme utilisée) et le nouveau graphique Vi = f [S] est construit à partir du calcul de la vitesse initiale sur les résultats expérimentaux. Le graphique obtenu constitue le support des activités suivantes.

Au cas où les résultats obtenus ne permettraient pas la construction du graphique, une série de résultats de substitution serait proposée.

  • Décrire précisément le graphique : comment varie Vi lorsque [S] varie entre 0 et la concentration maximale testée ?
  • Déterminer graphiquement la vitesse maximale (Vmax) de la réaction dans ces conditions ainsi que la concentration correspondant à la moitié de la vitesse maximale (Km).
  • Recherchez une explication à l’allure du graphique en termes d’interactions moléculaires entre enzyme et substrats. A quelles propriétés des molécules correspondent respectivement Vmax et Km ?
Résultats élèves séance 2

Après quelques données complémentaires apportées en classe sur les notions de cinétique enzymatique et de complexe enzyme-substrat et la généralisation du concept de cinétique de saturation (généralisation à d’autres exemples d’interactions protéine-ligand), il reste à explorer les caractéristiques moléculaires des enzymes qui rendent compte des interactions avec le substrat. Pour cela, on utilisera un logiciel de modélisation moléculaire qui permet d’obtenir et de manipuler des représentations tridimensionnelles des molécules à l’écran.


Troisième séance :

APPROCHE DES INTERACTIONS ENZYME-SUBSTRAT PAR MODELISATION MOLECULAIRE SUR ORDINATEUR

Objectifs méthodologiques

Manipuler des modèles moléculaires en trois dimensions avec l’ordinateur.

Objectifs cognitifs

Mise en relation de la structure tridimensionnelle de l’enzyme et de sa fonction.

Compte tenu des informations obtenues lors des séances précédentes, il s’agit maintenant d’explorer le complexe enzyme-substrat au niveau moléculaire.

Problème : Quelles caractéristiques moléculaires permettent d’expliquer la formation du complexe enzyme - substrat ?

Le travail est effectué sur une enzyme de la classe des protéases, la carboxypeptidase A, dont la visualisation tridimensionnelle est réalisée avec le logiciel RASMOL. Le choix de cette enzyme est lié simplement à la disponibilité des fichiers de coordonnées de l’enzyme seule et du complexe enzyme-substrat fournis sur le site BIO-GEO de l'INRP. D'autres exemples peuvent être aisément mis en oeuvre en téléchargeant les fichiers voulus à partir des banques de données internationales.

Après une étude structurale de la molécule enzymatique permettant de réinvestir les connaissances sur la structure des protéines, on cherchera à localiser le site actif et à caractériser les acides aminés qui le constituent puis à vérifier la complémentarité stéréospécifique entre le site actif et le substrat.

Etude structurale

Après chargement du fichier approprié et description de l’aspect général de la molécule, les différents niveaux de structuration des protéines sont identifiés sur l’exemple choisi à l’aide des fonctions appropriées du logiciel (représentations simplifiées et colorations spécifiques des structures affichées). C’est l’occasion d’un rappel des principales notions sur la structure des protéines nécessaires à ce type d’activité.

  • Rappeler la définition de la structure primaire. Indiquer le nombre d’acides aminés constituant la protéine et identifier les deux extrémités aminoterminale et carboxyterminale.
  • Rappeler la définition de la structure secondaire, identifier et dénombrer les éléments correspondants dans cette molécule.
  • Rappeler quelles liaisons sont susceptibles de maintenir la structure tertiaire, les sélectionner par le menu options et les afficher.
  • Cette molécule présente-t-elle une structure quaternaire ?

Complémentarité stéréospécifique
  • Rechercher la constitution chimique du substrat avec la commande séquence puis donner sa formule semi développée en s’aidant de la banque de données des acides aminés.
On attend ici que l’élève identifie le substrat présenté et le reconstruise sur le papier en s’aidant de la banque de modèles des acides aminés pour réinvestir les connaissances sur la liaison peptidique.

La position du substrat par rapport à l’enzyme sera ensuite recherchée par la réalisation de coupes successives du complexe enzyme-substrat.

  • Exprimer en une phrase synthétique les relations observées entre les deux molécules (enzyme et substrat).
La conclusion attendue est que les replis de la chaîne polypeptidique dessinent une poche dans laquelle vient se loger précisément le substrat qui occupe quasiment tout le volume disponible. Pour explorer plus en détails le site actif, il convient alors d’identifier les acides aminés qui limitent le site actif.

Exploration du site actif

En restreignant la représentation aux acides aminés proches du substrat, il devient possible d’identifier les acides aminés du site actif. En utilisant un marquage différent pour visualiser substrat et enzyme et en utilisant les fonctions adéquates pour identifier les constituants et mesurer les distances, on obtient une représentation détaillée du site actif. Il est même possible d’entrer dans le détail des mécanismes moléculaires comme le mouvement de fermeture du site actif mais cet aspect nous a semblé aller bien au delà des objectifs du programme.

  • Résumer les observations en quelques phrases. Expliquer la relation entre structure tertiaire et constitution du site actif.
On attend des réponses expliquant qu’un petit nombre d’acides aminés dispersés le long de la molécule d’enzyme sont regroupés et forment une sorte de poche dans laquelle vient se loger l’acide aminé formant l’extrémité C-terminale d’une chaîne peptidique. Ce sont les replis de la protéine en une structure tridimensionnelle (structure tertiaire) qui permettent à des acides aminés déterminés situés en des endroits éloignés de la chaîne de se regrouper en formant la poche du site actif.
  • Formuler une conclusion générale permettant d’expliquer la relation entre structure tridimensionnelle et spécificité de l’enzyme (hydrolyse des peptides possédant un acide aminé C-terminal à chaîne latérale volumineuse (tyrosine, phénylalanine).
La conclusion générale attendue doit éclairer la relation structure - fonction en expliquant comment la structure tertiaire délimite un site dont les caractéristiques géométriques correspondent, " en creux ", à celles d’une chaîne latérale aromatiques. Dans ce cas, la molécule de substrat est suffisamment proche de l’ensemble des acides aminés du site actif pour qu’ils puissent exercer leur action catalytique.

Résultats élèves séance 3


Quatrième séance (évaluation) :

EVALUATION : MISE A L’EPREUVE DU MODELE ; VERIFICATION DE SES CONSEQUENCES

Les différents résultats obtenus au cours des séances précédentes montrent que l’activité d’une enzyme dépend de la formation d’un complexe enzyme - substrat. La formation de ce complexe suppose une complémentarité stéréospécifique entre le site actif de l’enzyme et les molécules de substrat. On peut alors résumer la réaction par trois phases : fixation des substrats (formation du complexe E-S), action catalytique, libération des produits :

E + S  <===>  ES ® E + P

Dans ces conditions, et sachant que les enzymes sont des protéines, à quelles modifications de la vitesse initiale peut-on s’attendre dans les cas suivants ?

1- Action de la température.

2- Action du pH.

3- Action d’un inhibiteur (molécule capable de se lier au site actif mais ne subissant pas de transformation chimique).

4- Action de la concentration en enzyme.

Les différentes conditions seront testées par des groupes différents. Il s’agit de mesurer les effets des variations de ces facteurs sur l'activité enzymatique mesurée par la vitesse initiale de la réaction enzymatique.

  • Proposez les principes d’un protocole expérimental pour étudier l’action d’un des facteurs précédents sur la vitesse initiale de la réaction enzymatique.
  • Après acceptation du protocole par le professeur, réalisez-le et présentez les résultats sous forme d’un graphique Vi = f (température) ; Vi = f (pH); Vi = f [inhibiteur] ; Vi = f [Enzyme].
  • Analysez les résultats et proposez une explication au niveau moléculaire.
  • Les résultats obtenus sont-ils compatibles avec les connaissances acquises jusqu’ici sur les enzymes ?
Résultats élèves séance 4

Evaluation

De façon à évaluer les élèves à partir de critères diversifiés,  l'évaluation tient compte de l’observation du comportement des élèves lors de la manipulation du matériel, de la pertinence des protocoles proposés, du contenu des compte-rendus et de l'analyse des résultats obtenus lors de la dernière séance. La maîtrise des savoir faire techniques et celle des connaissances sont prises en compte : conception du protocole et sa justification ; savoir faire techniques (utilisation du matériel et des logiciels, manipulation des données, sorties graphiques éventuelles) ; explications et conclusions en relation avec les connaissances acquises sur les enzymes et avec celles acquises précédemment sur les protéines en général.


Bibliographie

1- Pol D. A propos d’enzymes et de leur utilisation pédagogique. Biologie - Géologie, 4-93
2- Bellart F. Quelques réactions enzymatiques pour des manipulations assistées ou non par ordinateur. Biologie - Géologie, 1-94
3- Bulletin officiel du ministère de l’éducation nationale. Numéro hors série, 24/09/1992
4- Coste M. & Ledoussal C. Diffusion et utilisation de l’informatique en sciences de la vie et de la Terre. Actes du colloque ENS-INRP, Informatique et communications dans l’enseignement des sciences de la vie et de la Terre (15-17/10/1997). INRP, 1997
5- Barrère J., Dupont J.Y., Salamé N. Structures et fonctions des molécules biologiques. INRP, 1997.
6- Durliat G. Expériences d'enzymologie avec l'électrode à oxygène et le système d'acquisition Orphy-Régressi (1, 2 et 3). Bulletins de l'EPI, 70, 71 et 72, 1991


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