RETOUR AU SOMMAIRE
UN OUTIL PEDAGOGIQUE ORIGINAL : LA BIOLUMINESCENCE
Retour aux articles


Des figures de plus haute résolution sont accessibles en cliquant sur les figures.

Introduction

Les êtres vivants sont le siège de transformations énergétiques particulièrement efficaces comparativement aux machines que l'Homme fabrique dont les rendements sont très faibles. La possibilité de transformer directement de l'énergie chimique en énergie mécanique, électrique ou lumineuse sans passer par un intermédiaire thermique explique en partie cette performance. Parmi toutes les formes d'énergie ainsi produites, l'une d'entre elles est particulièrement étonnante : c'est l'émission de lumière. Il s'agit toujours de lumière froide démontrant ainsi que la transformation de l'énergie chimique en énergie lumineuse n'est pas due à l'excitation thermique intermédiaire des électrons contrairement à ce qui se passe dans une ampoule électrique.

La bioluminescence existe chez plusieurs centaines de genres différents (environ 700 ont été dénombrés) appartenant au règne végétal comme au règne animal depuis les bactéries jusqu'aux vertébrés. Treize phylums possèdent des représentants doués de bioluminescence.

Le premier livre consacré à cette question fut De Luce Animalium du hollandais T. Bartholinus en 1647. A la même époque, l'Anglais Robert Boyle montra que la bioluminescence ne pouvait avoir lieu en l'absence d'air ce qui lui fit soupçonner la présence dans l'air d'une substance que son compatriote Priestley devait identifier plus tard comme l'oxygène. Mais, ce furent les travaux expérimentaux du Français Raphaël Dubois à la fin du siècle dernier qui posèrent les fondements de la connaissance scientifique de ce phénomène. Depuis, les informations sur les mécanismes et les fonctions de la bioluminescence se sont considérablement enrichies. Toutefois, de grosses lacunes subsistent encore, en particulier sur certains mécanismes biochimiques, sur la fonction de ce phénomène chez diverses espèces et sur son interprétation en termes d'évolution.

Les principales fonctions remplies par la bioluminescence concernent la communication intraspécifique (lucioles, crustacés ostracodes), la protection par des leurres (annélides polychètes, crevettes, poissons) ou par camouflage (poissons, calmars), la prédation, grâce à l'attraction lumineuse (diptères) et au mimétisme (lucioles, poissons). On se reportera à la bibliographie pour un panorama plus complet de cette question.

Le système bioluminescent le plus anciennement étudié et l'un des mieux connus est celui mis en jeu par les coléoptères comme les lucioles. Il présente l'avantage d'être facilement disponible pour des études in vitro, soit en capturant des lucioles dans la nature, soit en achetant les produits chez un fournisseur spécialisé. Par ailleurs, il permet d'aborder différents problèmes biologiques et l'expérience montre que les élèves sont, en général, captivés par ce singulier phénomène. Ce système peut donc s'avérer d'un grand intérêt pédagogique.

Nous examinerons successivement les bases biochimiques de la luminescence des lucioles puis les problèmes biologiques qu'il est possible d'aborder par des travaux pratiques. Enfin, les applications qui en sont faites dans les laboratoires de recherche ou d'analyse mais qui ne peuvent être mises en œuvre aisément en classe seront passées en revue plus succinctement.
 

I - Bases biochimiques

R. Dubois avait remarqué dès le XIXème siècle qu'un broyat dans l'eau d'organes lumineux de lucioles Pyrophorus, qu'on lui avait envoyées de la Jamaïque, émettait de la lumière pendant quelques minutes pourvu que le milieu contienne de l'oxygène. De plus, le même broyat réalisé dans l'eau bouillante se révélait inefficace mais permettait de restaurer l'émission lumineuse d'un broyat dont la luminescence avait cessé. Il en déduisit que la réaction chimique se déroulait entre deux substances, la luciférase, enzyme thermolabile, et la luciférine, son substrat, en présence d'oxygène. Bien que correct, ce principe réactionnel devait être affiné après la guerre par l'américain W.D. McElroy. Celui-ci montra que la réaction nécessitait un co-substrat, l'ATP, en présence d'ions Mg2+. Luciférine est un nom général sans signification chimique : il existe une grande diversité de molécules substrat (une trentaine) produisant de la lumière sous l'action de luciférases elles aussi très variées selon les espèces.

Chez les lucioles, la luciférine appartient au groupe des benzothiazoles. Au début de la réaction, l'ATP est hydrolysé et il se forme un intermédiaire luciférine-adénylate lié à l'enzyme avec libération du pyrophosphate. L'oxygène réagit alors sur cet intermédiaire en donnant un peroxyde tandis que l'AMP est éliminé. Le peroxyde se cyclise puis subit une décarboxylation donnant un carbonyle à l'état excité responsable de l'émission d'un photon lors de la relaxation. Le rendement de la réaction est particulièrement élevé puisqu'il est d'environ 0.9 quantum par molécule de luciférine. La longueur d'onde de la lumière produite ne dépend pas de la luciférine qui est la même, semble-t-il, chez toutes les lucioles bien que la couleur de la lumière émise varie suivant les espèces, mais de la luciférase. Cette dernière est une protéine dimérique de masse moléculaire égale à 100 kd dont le gène a été cloné et exprimé dans des bactéries et dans des cellules eucaryotes animales et végétales.

La figure 1 montre l'équation de la réaction chimique.

Il est important de noter, particulièrement dans le cadre des applications pédagogiques envisagées, que l'ATP ne constitue pas ici la source d'énergie de la réaction. Le mécanisme moléculaire exact qui produit l'état singulet excité nécessaire à l'émission d'un photon reste discuté. Le modèle proposé actuellement est dit CIEEL, pour Chemically initiated electron exchange luminescence. Dans ce modèle, l'énergie nécessaire à la production de l'état excité est fournie par des réactions d'oxydoréduction ne mettant en jeu qu'un seul électron.

II - Applications pédagogiques

Si on a l'occasion d'obtenir les animaux vivants, il faut les placer au congélateur immédiatement après la récolte.
Comme il est rarement possible de se procurer des lucioles, il est plus simple d'acheter les produits dans le commerce. SIGMA propose l'ensemble des produits nécessaires, soit séparément, soit sous forme de kit de démonstration. Le meilleur rapport qualité/prix a pour référence FFE-15 qui permet 15 démonstrations pour le prix de 270.00 F, environ. En diluant le mélange luciférine-luciférase, on peut faire davantage de démonstrations mais elles seront moins lumineuses. L'adresse de commande est :

SIGMA

L'Isle d'Abeau Chesnes
BP 701 38070 Saint Quentin Fallavier Cedex
Tél : 08002114 08 (numéro vert) ou 04 74 82 29 20

II-1 Applications en travaux pratiques

II-1-1 Démonstration de la bioluminescence

Avec des animaux congelés, il suffira de broyer l'abdomen dans l'eau avec un peu de sable dans un mortier pour observer la luminescence après avoir fait l'obscurité dans la pièce. Si la luminescence n'apparaît pas, l'addition d'un mL d'une solution d'ATP à 1 mg/mL la déclenchera.

Avec le kit Sigma, la manipulation est également très simple. Ce kit est composé de cinq flacons contenant un mélange luciférine + luciférase (extrait sec de 50 mg de lanterne de luciole par flacon) avec un tampon à l'arsenic (permettant de faire durer le phénomène plus de trois minutes) et de quinze flacons contenant 1 mg d'ATP et 40 mg de MgSO4. Ajouter 5 mL d'eau distillée dans un flacon de luciférine-luciférase et l'agiter légèrement pour dissoudre la poudre. Pipeter 1,5 mL avec une pipette équipée d'une poire (NE JAMAIS PIPETER A LA BOUCHE : PRESENCE D'ARSENIC DANS LE FLACON). Faire l'obscurité dans la salle et verser le contenu de la pipette dans le tube contenant l'ATP : immédiatement, une belle lumière verte apparaît et se maintient quelques minutes.

Pour obtenir de bons résultats, l'obscurité dans la salle doit être la meilleure possible et il faut attendre quelques minutes pour que l'œil s'y adapte.

Par souci d'économie, il est possible de doubler la quantité d'eau à ajouter au flacon du mélange luciférine-luciférase ce qui permet de doubler le nombre de manipulations. Bien évidemment, ce sera au détriment de l'intensité lumineuse obtenue.

II-1-2 Détection visuelle de l'ATP

En remplaçant la solution d'ATP par un extrait aqueux de divers tissus, l'apparition de la luminescence permettra la détection de la présence d'ATP à des concentrations de l'ordre de quelques micromol/L.

L'extraction de l'ATP, pour sa détection visuelle, est réalisée de la façon suivante : porter à ébullition 20 mL d'eau distillée et y jeter 5 g du tissu frais ou congelé (muscle, steak haché) découpé en petits morceaux. Maintenir l'ébullition tout en écrasant les fragments de tissu avec un agitateur et poursuivre pendant une dizaine de minutes jusqu'à ce que le volume de liquide atteigne environ 3 à 4 mL. Filtrer et récupérer le filtrat dans un petit tube. Dés que le filtrat a atteint la température ambiante et en respectant les mêmes précautions que précédemment (obscurité et adaptation visuelle), ajouter dedans 1,5 mL du mélange luciférine-luciférase. L'apparition de la luminescence montre la présence d'ATP.

Toutefois, la faible concentration d'ATP dans les tissus rend sa détection visuelle difficile. Pour cette raison, il est plus efficace d'utiliser un capteur physique pour détecter la lumière émise. Ce procédé permet alors l'utilisation de l'ExAO.

II-1-3 Détection de l'ATP par ExAO

 Matériel

Les résultats indiqués ici ont été obtenus avec un module Photocolor connecté à l'interface de mesure Orphy-GTS pilotée par le logiciel Regressi (Micrelec). Une cuve standard jetable de spectrophotomètre a été entourée de papier d'aluminium sur trois faces, la face disposée devant le capteur restant libre. Cet artifice est destiné à obtenir une réponse plus importante du capteur mais il n'est pas indispensable. Le colorimètre est mis en position "arrêt" de façon à fonctionner comme un détecteur de lumière.

Protocole

12,5 mg de l'extrait d'organe lumineux de luciole (LL) dans 1,5 mL d'eau ont été placés dans la cuve du colorimètre. Des quantités variables d'ATP (0,01 mg à 0,5 mg) dilué dans 2 mL d'eau ont été injectées dans la cuve à travers le couvercle. La figure 2 présente les tracés obtenus.

La bioluminescence apparaît immédiatement et se développe très rapidement. Elle décroît ensuite progressivement pendant quelques minutes avant de s'éteindre. L'intensité lumineuse émise par le mélange est proportionnelle à la concentration en ATP dans la cuve.

II-1-4 Mise en évidence de l'ATP dans des extraits tissulaires

Extraction de l'ATP

L'extraction de l'ATP a été menée sur un échantillon de steak haché congelé en raison de la facilité d'approvisionnement.

5 mL d'eau distillée contenant 50 mg de MgSO4 sont portés à ébullition dans une capsule en porcelaine. 1 g de l'échantillon est alors placé dans la capsule et écrasé avec un agitateur. Au cours de l'ébullition, 5 mL d'eau sont ajoutés mL par mL pour compenser l'évaporation. L'ébullition est poursuivie pendant une dizaine de minutes tout en continuant à triturer le mélange jusqu'à ce que le volume de liquide restant représente environ 2 mL. L'échantillon est filtré, l'ensemble du liquide étant récupéré en pressant sur le filtre. Le filtrat est utilisé sur le champ mais il peut être congelé pour un usage ultérieur.

Mesure

Un flacon de LL est dilué avec 6,5 mL d'eau pour permettre de réaliser 4 prélèvements de 1,5 mL représentant donc 12,5 mg chacun.

Un volume de 1,5 mL de LL est prélevé et placé dans la cuve du colorimètre. Le filtrat, qui ne doit pas dépasser un volume de 2 mL, est injecté dans la cuve à travers le couvercle après avoir déclenché l'acquisition des mesures.

Pour évaluer la concentration en ATP dans l'échantillon on a superposé le tracé obtenu à la suite de l'injection de l'extrait avec ceux réalisés lors de l'addition de quantités connues d'ATP : 0.020 et 0.025 mg respectivement. La figure 3 présente ces résultats.

Bien qu'on n'obtienne pas un pic de luminescence aussi intense avec l'extrait musculaire qu'avec 0,025 mg d'ATP, ceci vraisemblablement en raison des multiples substances présentes dans l'extrait et de la turbidité du milieu obtenu, l'allure des courbes suggère que la quantité d'ATP extrait est proche de 0,25 mg soit 49 nmol. On a donc ainsi un moyen simple d'évaluer la quantité d'ATP dans un échantillon.

Notons que la méthode d'extraction est très grossière mais que la simplicité du protocole permet néanmoins de montrer en classe la présence d'ATP dans un extrait tissulaire. Une méthode d'extraction plus sophistiquée accompagnée d'une courbe d'étalonnage permet, à un niveau supérieur d'enseignement, de réaliser un dosage précis de l'ATP.

 II-2 Problèmes biologiques abordables en classe à la suite de cette étude

Etant donné la nature de la réaction à l'origine de la bioluminescence, différents problèmes peuvent être abordés et discutés avec les élèves.
Le système ne se prête guère à une étude détaillée de cinétique enzymatique, mais la présentation ou la réalisation des expériences de Dubois est un excellent moyen de découvrir ou de concrétiser la notion d'enzyme et ne nécessite aucun équipement particulier même si elle reste possible par ExAO. On peut également étudier l'effet de la température ou du pH sur l'intensité et la durée de la réaction. La liaison avec le programme de seconde sur la communication animale, étudié par les élèves qui sont en 1S en 93-94, permettra de souligner la continuité des problèmes biologiques abordables à la fois au niveau de l'organisme (codage des signaux lumineux, photoémission, photoréception) et au niveau moléculaire (réaction enzymatique). De plus, à ce niveau, cela permettra de souligner l'importance des enzymes quel que soit le phénomène biologique étudié.

En première S, cette étude peut également permettre de souligner l'importance de l'ATP et le rôle des oxydoréductions dans les processus bioénergétiques. En effet, la source d'énergie de la réaction n'est pas l'ATP, qui joue ici un rôle d'activateur, tandis que se pose le problème de la transformation énergétique :

Energie libérée par oxydoréduction -- Energie lumineuse

De plus, la production d'un état excité pourra être mise en parallèle avec l'observation de la fluorescence de la chlorophylle.

En terminale, cette manipulation ouvre également des perspectives. On peut aller plus loin dans l'analyse de la réaction d'oxydoréduction et dans les problèmes d'efficacité des transformations énergétiques lorsqu'elles ne font pas appel à un intermédiaire thermique comme c'est le cas ici. De plus, l'état intermédiaire luciférine-adénylate peut être comparé à ce que l'on observe lors de l'activation des acides aminés en aminoacyl-adénylate permettant leur liaison aux ARNt lors de la synthèse protéique. Ce sera l'occasion de souligner que, finalement, l'analyse du fonctionnement cellulaire au niveau moléculaire montre que les phénomènes caractéristiques du vivant obéissent à des catégories générales en nombre limité en raison des contraintes physicochimiques. Comme on le voit, ces petites expériences visuellement spectaculaires permettent d'aborder nombre de problèmes fondamentaux.

L'utilisation du même principe est maintenant de routine dans les laboratoires et l'exposé de ces méthodes peut constituer un prolongement ou un approfondissement par rapport aux travaux pratiques.

III - Applications actuelles dans les laboratoires

De nombreuses applications peuvent être citées et certaines peuvent même être mises au point pour être utilisables en classe.

III-1 Applications analytiques

La possibilité de détecter l'ATP jusqu'à des concentrations aussi faibles que 2 picomol/L avec l'appareillage approprié a conduit à utiliser le système luciférine-luciférase non seulement pour la détection de quantités très faibles d'ATP, mais aussi pour celle de très nombreuses substances : toute réaction couplée libérant de l'ATP peut ainsi être mise en évidence. C'est par exemple le cas de la détection de la myokinase qui catalyse dans le muscle la réaction 2 ADP ---- ATP + AMP. Ce type de test est maintenant utilisé très largement aussi bien dans les laboratoires de recherche que dans l'industrie. D'autres systèmes analogues mais dépendant de coenzymes, notamment ceux des bactéries luminescentes, sont utilisés dans le même but, par exemple pour le dosage des transporteurs NAD ou NADP.

La bioluminescence est également utilisée pour réaliser des dosages immunologiques par couplage de l'enzyme à un anticorps. Le système n'est pas dangereux à manipuler, contrairement aux dosages radioimmunologiques, et il possède une excellente sensibilité car il existe maintenant des appareils capables de détecter des niveaux aussi bas de lumière que 104 photons par seconde !

La nécessité de l'oxygène pour produire la bioluminescence a permis de développer une électrode à oxygène originale utilisant des bactéries et un photomultiplicateur.

Enfin, l'utilisation de la luminescence de l'aequorine (protéine extraite de méduses luminescentes) en présence de calcium est bien connue et permet de localiser précisément les mouvements de calcium au sein des cellules.

III-2 Applications en génétique moléculaire

Le gène de diverses luciférases a été cloné et il est possible de le placer en tandem avec un autre gène que l'on cherche à greffer dans des cellules. Lorsque l'insertion dans le génome est réussie et si le gène de la luciférase s'exprime, il suffit de placer le substrat et les cofacteurs adéquats dans le milieu : la luminescence permet de vérifier que l'insertion a eu lieu. Il s'agit donc d'un marqueur d'insertion très pratique dont la détection possède une très grande sensibilité.

Conclusion

Ce phénomène ouvre donc d'intéressantes perspectives à la fois scientifiques, technologiques et pédagogiques. Sa mise en œuvre très simple permet de l'utiliser au lycée, même dans les établissement les moins bien équipés, et ce pour un coût raisonnable. Si on dispose d'une salle d'ExAO, on pourra évidemment pousser un peu plus loin son étude. La variété des sujets qu'il permet d'aborder à différents niveaux et plus particulièrement en 1°S et en terminale, les TP qu'il permet de réaliser (et bien d'autres sont imaginables) en font un outil véritablement exceptionnel et très attrayant pour les élèves.



BIBLIOGRAPHIE

Bassot J. M., Photogenèse in Encyclopaedia Universalis, 1990
Herring P. J., La luminescence des animaux, La Recherche, avril 1992
Lehninger A. L., Biochimie, Flammarion Médecine-Sciences, 1973
Prosser C. L., Neural and Integrative Animal Physiology, Wiley-Liss, 1991
Schnitter C., La bioluminescence bactérienne au service du génie génétique, La Recherche, juin 1991

RETOUR AU SOMMAIRE

TOUS DROITS RESERVES
© 1998-2006 D. Pol 
N'hésitez pas à faire connaître vos impressions, commentaires, suggestions etc.
dpol#noos.fr
Remplacer # par @ dans l'adresse indiquée
Emplacements des visiteurs de cette page