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TRAVAUX PRATIQUES DE BIOLOGIE
DES LEVURES
(Editions Ellipses, 1996)
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AVANT-PROPOS

Les levures sont les premiers microorganismes à avoir été utilisés par l'homme puisque la production de boissons alcoolisées par fermentation est documentée dès 6000 ans avant notre ère chez les Sumériens et les Babyloniens. Elles sont également les premiers microorganismes à avoir été observés au microscope par A. Van Leeuwenhoek qui les a dessinées vers 1680. Au XIXème siècle, c'est à la suite de ses travaux sur les levures que Pasteur contribua à la fondation de la microbiologie. Nul n'ignore ses succès et leurs retombées incalculables, particulièrement en termes de santé publique. A la même époque, la levure fut à l'origine du développement de la biochimie avec notamment les travaux de Büchner.

Ces microorganismes sont aussi largement utilisés dans divers secteurs de la recherche biomédicale et des biotechnologies. Ainsi, des levures modifiées génétiquement produisent l'antigène de surface du virus de l'hépatite B utilisé dans le vaccin anti-hépatite. D'autres produisent la sérum-albumine humaine.

Enfin, leur rôle historique d'auxiliaires dans le domaine de l'agroalimentaire ne s'est pas démenti et elles interviennent encore de nos jours dans la fabrication de nombreux produits alimentaires destinés à l’Homme (bière, vin, saké, pain etc...) ou aux animaux (protéines d'organismes unicellulaires ou P.O.U.).

Toutefois, l'intérêt historique ou économique voire médical n'est pas leur principal atout pour le scientifique : à l'heure actuelle les levures constituent un matériel expérimental de choix en raison de leur double état de microorganismes et d'eucaryotes et des centaines de laboratoires de recherche l'utilisent de par le monde avec des objectifs variés.

C'est chez la levure qu'ont pu être introduits les premiers chromosomes artificiels permettant ainsi le clonage de gènes dont la dimension interdisait l’utilisation de bactéries. C’est aussi désormais le premier eucaryote dont la séquence du génome est entièrement décryptée. Un programme international de recherche, soutenu par l'Union Européenne, a été lancé en 1988 pour entreprendre le séquençage complet du génome de la levure de bière, Saccharomyces cerevisiae, le plus petit génome eucaryote connu (14 000 kb). Huit ans après, la coopération d’une centaine de laboratoires européens, américains, canadiens et japonais a abouti au décryptage des 6200 gènes de la levure. Pour la première fois, on connaît la séquence complète de l’ADN d’un organisme eucaryote ce qui constitue une avancée majeure de la connaissance et devrait avoir de multiples retombées.

Cette rapide revue suffit à montrer l'intérêt de ces organismes dans les secteurs économiques et scientifiques les plus divers.

Les levures ont également un intérêt pédagogique majeur et, dans l'enseignement, on les utilise fréquemment comme organisme de laboratoire pour des travaux pratiques à toutes les étapes du cursus scolaire. Leur étude est devenue courante à la fois parce que les programmes scolaires prévoient depuis de nombreuses années l'étude du métabolisme énergétique au niveau cellulaire avec, notamment, la comparaison des fermentations et de la respiration, mais aussi car les levures permettent d'aborder des notions générales essentielles dans divers domaines de la biologie, de façon concrète en menant des travaux de laboratoire avec un matériel limité et peu coûteux. En effet, la facilité d'approvisionnement, de conservation et de mise en culture ainsi que la variété des espèces et souches disponibles sont des atouts majeurs pour les enseignants lors de la conception des séances de travaux pratiques.

Avec l'introduction d'une option sciences expérimentales dans les classes de 1°S des lycées et un thème spécifique consacré aux levures et aux industries de fermentation, les enseignants de biologie du secondaire ont désormais besoin de mettre en oeuvre de nombreuses manipulations faisant appel aux levures.

Mais ce n’est pas le seul domaine d’intérêt. La biologie des levures permet d’illustrer concrètement la plupart des principes fondamentaux de la biologie dans des domaines variés, biochimie, microbiologie, génétique, biologie cellulaire, biotechnologies etc... On dispose ainsi d’un organisme de laboratoire peu encombrant, peu exigeant et peu coûteux qui est aussi un outil polyvalent pour la mise en oeuvre à toutes les étapes du cursus scolaire de travaux pratiques intéressants et variés sans lesquels ne peut se concevoir un enseignement de sciences expérimentales digne de ce nom.

Ces considérations m'ont conduit à rédiger cet ouvrage à partir des manipulations menées, d’abord avec mes élèves puis avec de nombreux enseignants lors de stages de travaux pratiques pendant plusieurs années.

On trouvera donc dans cet ouvrage de nombreux ptotocoles destinés à aider les enseignants et le personnel de laboratoire dans la conception et la préparation de travaux pratiques utilisables dans diverses classes du secondaire.

Cependant, ces microorganismes présentant l'extraordinaire atout de pouvoir servir de support à des activités expérimentales depuis les plus élémentaires " leçons de choses " de l'école primaire jusqu'aux manipulations les plus sophistiquées envisageables à l'université, les manipulations et les expériences présentées dans cet ouvrage ne se limitent pas exclusivement à un niveau scolaire particulier : quelques manipulations élémentaires ne nécessitant aucun matériel spécialisé sont décrites et peuvent être mises à profit par tous ceux qui ont la charge de faire découvrir les sciences expérimentales à l'école primaire, au collège ou dans les clubs scientifiques. Publiées pour la plupart dans ma rubrique " Biologie Amusante " de la revue Science & Vie, ou dans l’" L’Expérience du Mois " qui lui a succédé, elles permettent d’aborder la biologie expérimentale de façon très simple et sans dépenses importantes.

D'autres, au contraire, font appel à des notions plus complexes ou nécessitent un laboratoire convenablement équipé et seront utiles aux enseignants aux niveaux secondaire et universitaire.

L'ambition de cet ouvrage est donc de présenter une grande variété de protocoles -environ quatre-vingt- permettant une étude pratique non seulement des structures et des fonctions des levures mais aussi de notions beaucoup plus générales à tous les niveaux d'enseignement.

L'ouvrage est divisé en cinq chapitres précédés chacun d'une introduction générale donnant des informations de base sur le domaine concerné. En outre, des informations plus précises sont données avant la description de la plupart des manipulations afin d'en éclairer les principes scientifiques et les résultats.

Dans le premier chapitre, on trouvera les informations nécessaires pour s'approvisionner en diverses espèces et souches de levures. En effet, si de très nombreuses manipulations peuvent se faire avec la levure de boulangerie, S. cerevisiae, d'autres nécessitent le recours à des espèces ou à des souches particulières. On trouvera également dans ce chapitre la description des techniques de la microbiologie que l'on utilise en routine pour cultiver, étudier et conserver les levures.

Le chapitre II concerne principalement les observations réalisables au microscope optique et les manipulations qui y sont liées. On y trouvera notamment des techniques de coloration élective de certaines structures cellulaires, des techniques de mesure portant sur les cellules et des observations sur le cycle cellulaire.

Dans le chapitre III sont décrits des protocoles expérimentaux et des méthodes de mesure en rapport avec le métabolisme énergétique. On y trouvera diverses méthodes de caractérisation et de mesure de la respiration, de la fermentation alcoolique et du contrôle métabolique.

Le chapitre IV est plus particulièrement axé sur la mise en évidence et l'étude des enzymes et autres protéines et sur des manipulations qui les utilisent directement.

Le chapitre V se rapporte à la génétique. On y trouvera diverses manipulations destinées à illustrer les principes et les méthodes de la génétique formelle et de la génétique moléculaire.

L’ensemble des réactifs, milieux de culture et solutions diverses sont décrits dans le chapitre VI pour éviter d’alourdir la description des protocoles qui les utilisent.

Plusieurs méthodes différentes sont souvent disponibles pour l’étude d’un même problème. Dans la mesure du possible, la plupart des méthodes courantes ont été décrites de façon à ce que chacun puisse choisir la méthode la mieux adaptée à son environnement matériel. Cependant, pour éviter les redondances, chaque expérience décrite n’est envisagée qu’avec une seule technique d’étude. Certains protocoles décrits avec une technique donnée sont néanmoins souvent envisageables avec des techniques présentées dans le cadre d’autres expériences notamment pour les mesures de respiration et de fermentation.

Pour chaque manipulation, en plus des informations permettant de comprendre les principes scientifiques de l'expérience, on trouvera également des exemples, purement indicatifs, d’objectifs méthodologiques et cognitifs, à usage pédagogique. En outre, dans de nombreux cas, des exemples concrets de résultats sont présentés.

Pour chaque manipulation, une indication de niveau est donnée sous forme d’une à trois étoiles : les activités élémentaires ne nécessitant aucun matériel particulier comportent une étoile. Celles destinées à un niveau scolaire allant du collège au lycée en comportent deux tandis que celles nécessitant soit un matériel de laboratoire plus sophistiqué, soit des connaissances plus approfondies sont marquées par trois étoiles.

Chaque fois que des expériences assistées par ordinateur (ExAO) sont réalisables, des protocoles et des exemples de résultats sont présentés. Ils ont été obtenus avec des capteurs ou des appareils du commerce reliés à une interface d’acquisition de données pilotée par un logiciel généraliste. Les descriptions de cette technique sont maintenant si répandues qu’il m’a paru inutile de détailler son aspect technique qui ne doit pas cacher les invariants que sont les principes des expériences.

Enfin, une liste des fournisseurs, un index et une bibliographie complètent cet ouvrage qui, je l'espère, rendra service à nos collègues désireux d'utiliser ces extraordinaires organismes que sont les levures pour développer l'esprit scientifique en général et la démarche expérimentale en particulier chez les jeunes dont ils ont la charge.

D. Pol



INTRODUCTION : informations générales sur les levures

Les levures sont des champignons unicellulaires et présentent donc une structure cellulaire eucaryote. Leur seule caractéristique commune est l’état unicellulaire bien que de nombreuses levures soient aussi capables de faire dans certaines conditions un pseudo-mycélium comme le genre Brettanomyces, voire un véritable mycélium comme Candida albicans.

Quoique les cellules des levures ne soient pas mobiles par elles mêmes, l'état unicellulaire favorise leur dissémination dans les liquides qui constituent leur milieu de prédilection surtout lorsqu'ils sont sucrés. Mais on trouve également des levures à la surface ou à l'intérieur d'autres êtres vivants, dans les sols, dans les eaux et dans l'atmosphère.

Les levures furent reconnues comme des champignons par A. de Bary en 1866 lorsqu'il détecta des ascospores chez la levure de bière. Quelque 500 espèces de levures réparties dans une cinquantaine de genres sont maintenant identifiées et diverses classifications ont été proposées. Pourtant, le terme "levure" n'a pas de véritable signification systématique et les levures constituent une entité biologique hétérogène : elles appartiennent à trois classes de champignons, les ascomycètes, les basidiomycètes et les deutéromycètes (champignons "imparfaits") et parmi ces classes à plusieurs familles. Le terme "levure" n'implique pas non plus automatiquement des capacités que nous sommes habitués à lui associer comme la fermentation ou le bourgeonnement qui n'existent, en fait, que chez certaines espèces. Cependant, les levures les plus communément utilisées, telle Saccharomyces cerevisiae, présentent ces deux caractéristiques.

On distingue des "levures vraies", celles produisant des spores encore appelées levures sporogènes et des levures imparfaites.

Les premières sont soit des hémiascomycètes (levures ascosporogènes), soit des basidiomycètes (levures basidiosporogènes). Les "levures fausses" ne produisent pas de spores et appartiennent aux deutéromycètes.

Tous les modes de vie connus chez les champignons se rencontrent chez l'une ou l'autre espèce de levure et on trouve ces champignons dans pratiquement tous les habitats de la planète.

Si la plupart sont saprophytes, certaines d'entre elles sont parasites comme Candida albicans et Cryptococcus neoformans, germes opportunistes fréquents chez les malades immunodéprimés (en particulier ceux infectés par le virus de l'immunodéficience humaine) tandis que d'autres sont symbiotiques comme celles vivant dans les corps adipeux de cochenilles.

Des caractéristiques physiologiques et génétiques éminemment variables, y compris au sein d'une même espèce, et des modalités diverses des mécanismes de reproduction rendent la classification de ces organismes particulièrement délicate mais ce problème ne constitue pas un obstacle à leur utilisation pédagogique.

L'état unicellulaire, la capacité à se multiplier rapidement et la rusticité des exigences nutritionnelles confèrent à ces eucaryotes des qualités qui permettent de les cultiver, de les étudier et de les utiliser aussi facilement que des microorganismes procaryotes. Comme l’écrit joliment James D. Watson, ce sont les " Escherichia Coli des eucaryotes ".

Enfin, comme il est facile et peu onéreux de s'en procurer, qu'elles peuvent être cultivées et manipulées sans danger pour la plupart et qu'elles permettent d'aborder de multiples problèmes biologiques fondamentaux, elles représentent un exceptionnel organisme de laboratoire qui mérite d’être connu et largement pratiqué.

Bien que des informations concernant la biologie des levures soient présentées dans chaque chapitre, cet ouvrage est à vocation essentiellement pratique. Aussi, si l’on désire approfondir la biologie des levures, on voudra bien se reporter à la bibliographie. 


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