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ÉLECTROPHORÈSE D'ADN SUR GEL D'AGAROSE
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La meilleure méthode de coloration alternative de l'ADN


Une méthode particulièrement efficace et bon marché

L’électrophorèse en général, en particulier l’électrophorèse d’ADN sur gel d’agarose, est une des techniques de base aussi bien dans la recherche en biologie moléculaire que dans les applications biotechnologiques. L’électrophorèse de protéines sur gel d’agarose ou sur acétate de cellulose ne présente guère d’obstacle technique et est couramment mise en œuvre dans les établissements d’enseignement, notamment au lycée, pour identifier et comparer des protéines. L’électrophorèse d’ADN sur gel d’agarose permet d’aborder de manière concrète les fondamentaux de la biologie moléculaire car c’est un outil indispensable à la résolution de problèmes divers dans des domaines variés (phénotype et génotype, médecine,  OGM, police scientifique, agroalimentaire). Elle est moins répandue comme outil pédagogique car elle nécessite typiquement l’utilisation de bromure d’éthidium, substance hautement toxique à déconseiller dans l’enseignement, et un illuminateur UV, matériel coûteux.
Toutefois des méthodes de coloration alternative ont été proposées, notamment par le bleu de méthylène ou mieux par l’azure A, permettant d’éviter le recours au bromure d’éthidium et aux UV mais ne donnant pas satisfaction à tout le monde en raison de leur sensibilité moins bonne et de la coloration de fond parfois difficile à éliminer. La méthode présentée ci-dessous est non seulement plus sensible que les précédentes méthodes alternatives mais, en outre, la coloration de fond est nettement moins intense et elle est facile à éliminer simplement à l’eau distillée. Enfin, le coût du colorant utilisé reste très modéré (de l’ordre de 2 Euros par gramme alors que quelques mg suffisent pour de nombreux gels).
Les clichés montrent deux gels d'agarose avant et après décoloration et éventuel traitement numérique pour en améliorer la lisibilité.
La signification des différentes bandes est indiquée ci-dessous.

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Durée de coloration : 15 h
Gels après coloration par le bleu de Nile

Un traitement numérique des images fait apparaître les bandes d'ADN en négatif facilitant leur visualisation.

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Après 1 h de coloration
(cliché numérique sur table lumineuse)

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Après décoloration dans l'eau distillée
(Cliché numérique sur table lumineuse. Face supérieure des gels)

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Après décoloration dans l'eau distillée
(Image obtenue par scanner. Face inférieure des gels)

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Après décoloration
(Traitement numérique de l'image pour obtenir l'effet négatif)


Informations techniques
Gel d'agarose à 0,8 % dans tampon TBE, pH 8,2
Gel gauche :
1 :  ADN de phage lambda digéré par HindIII (2 µg)
2 : ADN de phage lambda digéré par EcoRI + HindIII (2 µg)
3 : ADN de phage lambda - pUC Mix* (4 µg)
4 : ADN génomique de lentille extrait grossièrement (quantité inconnue)
Gel droit :
1 : ADN de phage lambda - pUC Mix* (4 µg)
2 : ADN de phage lambda digéré par EcoRI + HindIII (2 µg)
3 : ADN de phage lambda digéré par HindIII (2 µg)
4 : ADN de phage lambda digéré par EcoRI (1 µg)
* pUC Mix Marker : ADN de phage lambda digéré entièrement par Eco130I et Eco81I plus ADN du plasmide pUCGK57 entièrement digéré par HindIII.
L'hydrolysat donne théoriquement 14 fragments d'ADN dont la taille s'échelonne de 74 à 19329 paires de bases (bp) :
19329, 7743, 5526, 4254, 3281, 2690, 2322, 1882, 1489, 1150, 925, 697, 421, 74 (invisible).
Il peut s'établir une ligation entre fragments de 19329 bp et 4254 aboutissant à une bande de 23583 bp.



Les échantillons d'ADN, lorsqu'il est extrait selon une méthode grossière, montrent constamment une bande intensément colorée, de faible poids moléculaire, qui migre en avant du "smear". Le smear est une bande continue occupant toute la piste d'électrophorèse et qui reflète la diversité de taille des fragments obtenus lors de l'extraction de l'ADN génomique, en raison de la fragilité des molécules d'ADN. Un smear est visible sur le gel placé à gauche dans les clichés ci-dessus et dans les trois bandes de droite du cliché ci-dessous. La bande intensément colorée en avant du smear est interprétée habituellement comme de l'ARN (l'ADN génomique du commerce n'en présente pas car il est parfaitement purifié). Pour vérifier cette hypothèse, de l'ADN génomique de lentille extrait selon la technique la plus simple a été soumis à l'électrophorèse. Un puits a reçu de l'ADN de lentille extrait grossièrement et un autre puits a reçu le même extrait de lentille traité par la RNase A pendant 30 min, traitement qui détruit les ARN. De l'ADN génomique du commerce (thymus de veau) et des marqueurs de taille ont été soumis à l'électrophorèse en parallèle avec l'ADN extrait des lentilles. La photo ci-dessous présente le résultat obtenu.

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Gel d'agarose coloré par le bleu de Nile
1. Marqueurs de taille (ADN de phage lambda digéré par EcoRI et HindIII : Promega)
2. ADN génomique de thymus de veau (Sigma)
3. ADN de lentille extrait grossièrement puis traité par la RNAse A.
4. ADN de lentille extrait grossièrement, non traité

La disparition de la bande après traitement par la RNase A confirme qu'il s'agit bien d'ARN. Ainsi, la méthode d'extraction particulièrement simple employée pour obtenir l'ADN génomique, ne permet pas de distinguer ADN et ARN.
 

Coloration de l’ADN par le bleu de Nile
 

  • Solution stock (concentrée 100 fois) à conserver au réfrigérateur : dissoudre 10 mg de bleu de Nile dans 5 mL d’eau distillée.
  • Solution de travail : 1 mL de la solution stock dans 100 mL d’eau distillée. Selon la taille de la cuve de coloration, il faut de 100 à 300 mL de la solution de travail.
  • Placer le gel dans la solution de travail et le laisser se colorer pendant 1 h à 2 h.

  • Les bandes d’ADN apparaissent en bleu foncé sur un fond bleu clair et peuvent être observées et photographiées dès ce stade (voir cliché).
  • Il est possible de laisser le gel dans le colorant pendant une nuit à température ambiante sans altération des résultats.
  • Si l’on désire décolorer le fond, mettre le gel à tremper dans l’eau distillée et changer deux fois le bain de rinçage.

  • La coloration des bandes se conserve pendant quelques mois si le gel est conservé, après coloration, dans un récipient étanche contenant quelques mL d’eau distillée de façon à ce que le gel ne soit pas immergé. Attention, il devient alors plus fragile.


Fournisseur ADN :
PROMEGA distribué par EUROMEDEX
Fournisseur bleu de Nile :
Nile blue, SIGMA   Réf H 5632

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