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Observation de chromosomes géants
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Réalisation de préparations microscopiques 
de glandes salivaires de larve de drosophile

  • Introduction
  • La drosophile
  • La larve
  • Protocole
  • Colorant
  • Fournisseurs

  • Voir aussi : Réalisation de préparations microscopiques de glandes salivaires de larve de chironome
     
    • Introduction
    Chez les larves de certains insectes diptères comme celles de la drosophile ou du chironome (« ver de vase »), quelques tissus (glandes salivaires, intestin, tubes de Malpighi) possèdent des cellules dotées de chromosomes géants appelés chromosomes polyténiques. Ces chromosomes d'un type particulier ont été décrits pour la première fois en 1881 par le biologiste français Edouard Balbiani (1822-1899) alors qu'il étudiait des préparations microscopiques de tissus larvaires de chironome colorées par le vert de méthyle. L'étude de ces chromosomes s'est révélée fructueuse, notamment pour la résolution de problèmes en rapport à la fois avec la génétique fondamentale et la cytogénétique. 

    Dessin original de Balbiani
    (chromosomes géants de chironome)
    Les chromosomes géants peuvent atteindre près d'un demi millimètre de long et quelque 20 µm d'épaisseur et sont donc aisément visibles au microscope optique. Leur taille considérable est due au phénomène de polyténie. Chaque chromosome géant est constitué de l'accolement sur toute leur longueur de 2n chromatides issues de n cycles mitotiques sans cytodiérèse. En outre, les chromatides s'allongent et restent accolées de façon parfaitement alignée rendant ainsi beaucoup mieux visible la structure fine du chromosome. Chaque chromosome géant présente une alternance caractéristique de bandes transversales. L'organisation des bandes est déterminée génétiquement autorisant les corrélations entre la localisation des bandes et l'emplacement des gènes. Il est ainsi possible d'observer directement les conséquences de différents remaniements chromosomiques comme les inversions et les translocations et de déterminer l'emplacement des gènes sur les chromosomes. De plus, l'étude des anneaux de Balbiani ou  puffs, (un puff est un gonflement localisé et temporaire d'une courte section d'un chromosome géant à un stade déterminé du développement dans un tissu déterminé) a permis de mieux comprendre certains mécanismes de l'expression des gènes, notamment leur induction sous l'effet de signaux extérieurs comme l'hormone ecdysone.
     
    • La drosophile (Drosophila melanogaster)


    La drosophile est un insecte à métamorphoses complètes (holométabole) dont le cycle vital comporte plusieurs stades larvaires mobiles séparés par des mues, un stade nymphal immobile, la pupe, qui conduit au stade imaginal, l'état adulte, à la suite d'une métamorphose.
    Les glandes salivaires de la larve de drosophile sont formées d’un petit nombre de cellules contenant des chromosomes géants. Bien que la larve asticot de la drosophile mesure seulement quelque 3 à 4 mm au dernier stade, l’observation des chromosomes géants au microscope ne présente aucune difficulté technique et est aisément réalisable avec du matériel courant de laboratoire pourvu que l’on dispose d’une loupe binoculaire et d'un microscope. L’élevage de drosophiles étant une pratique courante dans les laboratoires de SVT des établissements d’enseignement, en particulier pour réaliser des croisements et pour observer des mutants, il est facile de se procurer des larves au dernier stade avant la pupaison. On peut aussi commander des drosophiles chez un fournisseur, s'en procurer auprès d'un laboratoire universitaire ou en capturer au printemps ou en été en plaçant un coton imprégné de quelques gouttes de vin ou de vinaigre au fond d'une bouteille fermée par un petit entonnoir introduit dans le goulot.
     


    Drosophile mâle vue latéralement
    (longueur : 3-4 mm)
    Drosophile vue dorsalement
     
    • La larve
    Sous la loupe binoculaire, la larve asticot a l’aspect ci-dessous. Le corps est segmenté et l’extrémité antérieure plus effilée est aussi reconnaissable par la direction du déplacement. Le tube digestif est visible par transparence, en particulier les pièces buccales chitineuses, de couleur noire, en arrière de la bouche.
     
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    Larve asticot de drosophile au dernier stade
    (longueur : 3-4 mm)
    Interprétation
    Lorsque la larve entre en pupaison, il n'est plus possible de prélever les glandes salivaires. La pupe est immobile et ne se nourrit pas, contrairement à la larve. Elle mesure environ 3 mm. La métamorphose, déconstruction de la larve et reconstruction de l'adulte, se produit au sein de la pupe dont sort l'imago, insecte adulte.

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    Pupe
    Noter la segmentation de la cuticule et les appendices

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    Imago à l'éclosion
    Noter les ailes non encore déployées

    Les glandes salivaires qui débouchent dans le tube digestif en arrière de la bouche sont situées à la partie ventrale du corps. Pour les prélever, il faut séparer le corps de l’asticot en deux parties inégales entre les deuxième et troisième segments du corps : lorsque la tête est arrachée, elle entraîne avec elle l’extrémité antérieure du tube digestif rattachée aux glandes salivaires paires.
    Pour cela, il est nécessaire d’utiliser une loupe binoculaire. La larve est placée sur une lame porte objet et la pointe d’une pince fine ou une aiguille est utilisée pour l’immobiliser tandis qu’une seconde pointe sert à arracher la tête. Une fois isolées, les glandes salivaires sont colorées avec un colorant électif de l'ADN permettant d'observer les chromosomes.
     

    Protocole    
    • Immobiliser la larve au niveau du troisième segment avec une des pointes tenue dans une main.
    • Piquer au niveau de la tête avec la pointe tenue dans l'autre main.
    • Faire glisser cette pointe vers l'extérieur pour écarter puis arracher la tête.
    • Eliminer de la lame les restes de la partie postérieure du corps.
    • Il reste alors sur la lame l'extrémité antérieure du tube digestif, transparente, reconnaissable à la chitine des pièces buccales, seul élément pigmenté en noir. Les glandes salivaires ont la forme de deux très petites masses arrondies reliées au tube digestif par un mince canal.
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    Technique d'extraction des glandes salivaires
    • Recouvrir l'échantillon d'une goutte de colorant et laisser agir 5 à 10 minutes.

    Echantillon recouvert d'une goutte d'orcéine acétique
    • Recouvrir d'une lamelle.
    • Appuyer légèrement sur la lamelle avec une pince tenue à l'envers pour étaler au mieux les tissus.

    Etalement
    • Repérer au faible grossissement du microscope l'échantillon sur la lame.
    • Le parcourir au grossissement moyen pour identifier les cellules des glandes salivaires, très grandes et donc bien visibles.

    • Sur le cliché ci-contre, noter les cellules déchirées par l'étalement.
    • Observer au fort grossissement et si possible avec un objectif à immersion pour distinguer les détails des chromosomes colorés par l'orcéine, colorant électif de l'ADN.

    • NB Le bleu de toluidine et le vert de méthyle donnent également de bons résultats.

      Pour tous les clichés présentés :
      Préparations extemporanées.
      Coloration par l'orcéine acétique. 
      Photographies numériques.
       
       

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    Cellules de glande salivaire (x 100)
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    Une cellule intacte (x 400)
    Noter l'alternance de bandes sombres et claires sur les chromosomes.
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    Zoom numérique x 4 sur le noyau (x 400)
    Les bandes apparaissent distinctement
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    Un autre noyau vu avec une mise au point différente (x 400)

    Avec l'objectif à immersion, la succession de différents plans optiques en jouant sur la vis micrométrique permet de suivre les chromosomes enchevêtrés.
     

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    Un même noyau photographié à trois profondeurs de champ différentes
    (x 1000, objectif à immersion)


    La même technique appliquée à des larves de chironome (vers de vase) permet d'obtenir des résultats comparables.

    Préparation du colorant


    Orcéine acétique, solution stock 
    Dissoudre 1 g d’orcéine dans 45 mL d’acide acétique pur. 
    Faire bouillir jusqu’à dissolution et laisser refroidir.
    Filtrer et conserver le filtrat au réfrigérateur.
    Solution diluée à préparer extemporanément 
    Mélanger 9 mL de solution stock avec 11 mL d’eau distillée.

    Fournisseurs


    Drosophiles
    SORDALAB 
    (distribue aussi divers kits de TP) 
    Z.A. Les Poupettes 
    91580 Villeneuve sur Auvers 
    Téléphone : 01 69 92 26 72 
     
    Orcéine
    Référence O 7380 
    1 g : 13,60 € (tarif 2002)
    SIGMA 
    L’Isle d’Abeau Chesnes, BP 701 38297 Saint Quentin Fallavier Cedex 
    Tel : 0474822800 
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