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INVESTIGATIONS SUR UNE SOUCHE DE LEVURE QUI NE FERMENTE PAS LE SACCHAROSE

PROTOCOLES EXPÉRIMENTAUX


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Les protocoles présentés ici sont destinés à faciliter la mise en œuvre des expériences nécessaires pour résoudre le problème posé. Ils permettront à ceux qui veulent lancer leurs élèves dans ce type d'investigation de ne pas perdre de temps à rechercher les procédures adéquates, les concentrations optimales des solutions, les conditions de telle ou telle expérience etc. Tous peuvent être mis en œuvre avec le matériel courant disponible dans les lycées.
On comprendra que certains aspects de la biologie des levures en général (régulation métabolique) et de l'expression génétique en particulier (régulation transcriptionnelle du gène suc2) ont été passés sous silence pour ne pas introduire trop de connaissances supplémentaires par rapport aux programmes officiels. Toutefois, selon la façon dont les élèves s'impliquent dans ce type de projet expérimental "ouvert" il est parfaitement envisageable d'évoquer ces aspects.


1- REPIQUAGE DE LA SOUCHE ET PRODUCTION DE BIOMASSE.

Objectifs : maintenir la souche au laboratoire et disposer d’une quantité suffisante de levure sac-.

Protocole

Des boîtes de milieu complet solide sont préparées et ensemencées en conditions stériles pour assurer la conservation de la souche sous forme de colonies.


Culture sur milieu complet

Le même milieu, dépourvu d’agar pour rester liquide, est ensemencé et incubé quelques jours pour obtenir une quantité importante de levure.

 
Milieu complet  
Bactopeptone  10 g
Extrait de levures  10 g
Glucose  20 g
Eau distillée  1 L
Agar (milieu solide)  20 g
2- VERIFICATION DU CARACTERE " INCAPACITE A FERMENTER LE SACCHAROSE (SNF) "

2.1 Etude du métabolisme fermentaire par ExAO

Objectifs : vérifier l’absence de fermentation du saccharose à court terme en mesurant l’éthanol ou le CO2 éventuellement produits et comparer d’une part avec la fermentation du glucose par la même souche et d’autre part avec la fermentation du saccharose par une souche non déficiente

Protocole

1- Préparer à partir de colonies sur milieu solide deux suspensions de levures SNF et une d'une souche sauvage à raison de 200 mg dans 4 mL de tampon phosphate pH 5.6.
2- Préparer une solution de glucose et une solution de saccharose à 450 mmol.L-1 dans le tampon et la placer au bain-marie.
3- Transférer chaque suspension de levures dans le flacon approprié.
4- Placer les flacons au bain-marie, mettre en place le capteur sur le bouchon et laisser la température s'équilibrer une dizaine de minutes.
5- Laisser couler lentement 2 mL de chaque solution de substrat le long du flacon avec une seringue munie d’une aiguille en évitant d’agiter le milieu.
6- Enregistrer la réponse du capteur pendant 15 à 30 minutes et sauver les données.
7- Comparer les résultats obtenus dans les trois cas.

2.2 Culture sur milieu solide au saccharose additionné d’un indicateur de pH

Objectif : déterminer si les cellules sont déficientes pour l’utilisation à long terme du saccharose.

Le virage d’un indicateur de pH est utilisé pour détecter la fermentation qui libère du CO2 et des acides organiques. On détermine ainsi la capacité de la souche à fermenter le saccharose. Si, contrairement à ce qui est attendu, le milieu vire au jaune, cela signifie que la souche est apte à fermenter le saccharose et doit être rejetée pour cette étude.

Protocole

1- Préparer un litre de milieu au saccharose et y incorporer le pourpre de bromocrésol avant stérilisation
2- Diluer une suspension de levures de façon à obtenir environ 1000 cellules par mL.
3- Etaler soigneusement 0.1 mL de la suspension diluée à la surface de la boîte avec un étaleur.
4- Procéder de même avec une autre boîte et une suspension de levures sauvages (témoin).
5- Incuber jusqu’à apparition des colonies.
 
 

Milieu au saccharose Indicateur au pourpre de bromocrésol
Bactopeptone : 10 g Dissoudre 200 mg de pourpre de bromocrésol dans 100 mL d’éthanol absolu
Extrait de levures : 10 g Incorporer 9 mL de cette solution par litre de milieu
Saccharose :  20 g
Eau distillée :  1 L
Agar 20 g

2.3 Culture en présence de disques imprégnés de différents sucres (glucose, fructose, saccharose, maltose, raffinose)

Objectif : comparer la croissance avec du saccharose et d’autres substrats fermentescibles proches chimiquement du saccharose comme le raffinose, (galactosyl a 1-6 glucosyl b 1-2 fructose), trioside qui possède un type de liaison identique à celle du saccharose et le maltose (glucosyl a 1-4 glucose) qui est un dioside.

Une suspension de levures sac- est étalée sur un milieu minimum sans source de carbone et des disques imprégnés des divers sucres à tester sont disposés à la surface du milieu. La croissance des colonies ne se produit qu’autour des disques imprégnés des sucres utilisables. Une boîte témoin est réalisée avec une souche sauvage.

Protocole

1- Mettre en suspension une colonie jeune dans 10 mL d’eau distillée stérile.
2- Etaler soigneusement 0.1 mL de la suspension avec un étaleur à la surface d’une boîte du milieu précédent sans sucre.
3- Déposer à la surface de la boîte les rondelles de papier filtre stérile imprégnées des sucres à tester. Les rondelles sont saisies avec des pinces stérilisées à la flamme et un espace d’environ 2 cm est laissé entre elles.
4- Incuber 2 jours à 30°C.
 

Préparation des rondelles de papier
1- Préparer des solutions stériles des sucres à tester (glucose, saccharose, maltose, mannose, fructose, raffinose) à 20 g/100 mL d’eau distillée.
2- Déposer 2 gouttes de chaque solution sur des rondelles de papier filtre stérile de 0.5 à 1 cm de diamètre découpées à l’emporte-pièces et placées au fond de boîtes de Pétri stériles (une boîte par sucre).
3- laisser sécher (pour accélérer le séchage, placer les boîtes à l’étuve à 40°C).
 
Test des rondelles
Noter les colonies développées autour de deux rondelles

3. RECHERCHE DE L’ACTIVITE INVERTASE DANS LE MILIEU DE CULTURE

Objectif : l'incapacité à fermenter le saccharose est-elle due à l'absence d'activité invertase dans le milieu extracellulaire ?

Du saccharose est mis en présence du milieu de culture des levures après séparation des cellules de leur milieu. Si de la saccharase a été exportée, elle va catalyser l'hydrolyse du saccharose en glucose et fructose ce qui est le cas chez la souche sauvage (témoin). Le glucose formé est détecté avec des bandelettes enzymatiques ("Clinistix"). Si aucune hydrolyse n’est détectable, cela montre qu’il n’y a pas d’activité invertase extracellulaire chez cette souche de levure.

Protocole

1- Mettre en suspension une colonie de souche sauvage et une colonie sac- chacune dans 50 mL de milieu complet contenant 20 g.L-1 de mannose et 0.1 mol.L-1 d’hydrogénocarbonate de sodium (ce dernier active la sécrétion d'invertase).
2- Incuber 1 à 2 jours à 40°C avec une agitation douce (la température élevée favorise la sécrétion de l'invertase).
3- Centrifuger chaque culture et récupérer les surnageants.
4- Incuber au bain-marie à 30°C pendant 15 min, 2 mL de chaque surnageant avec 2 mL d’une solution de saccharose à 5 g.L-1.
5- Faire un test avec une bandelette de détection du glucose.

On attend ici la confirmation de l’absence d’activité invertase extracellulaire (le test doit être négatif avec la souche ATCC 56795 et positif avec la souche sauvage).

Tous les tests menés dans cette partie doivent se révéler négatifs justifiant la suite des investigations. Dans le cas contraire, on recherchera les causes d’un éventuel test positif.

4. RECHERCHE D’UNE ENZYME INACTIVE DANS LE MILIEU EXTRACELLULAIRE

Objectif : détecter une éventuelle forme non fonctionnelle d'une invertase extracellulaire.

Sur deux support d’électrophorèse identiques seront déposés des échantillons du précipité obtenu à partir du milieu extracellulaire d'une culture de la souche sac-, et d’une invertase du commerce (SIGMA). Après électrophorèse, le gel est coloré (bleu de Coomassie) de façon à pouvoir localiser précisément, le cas échéant, une invertase inactive par comparaison des électrophorégrammes.

Protocole

On utilise un gel d'agarose prêt à l’emploi (MIDI GEL).

1- Déposer des échantillons de 10 µL des solutions à tester (100 mg de précipité et 100 mg d'invertase pure par mL dans un tampon tris-véronal pH 8.6) en parallèle avec une goutte de colorant de charge pour électrophorèse.
2- Mettre sous tension (une centaine de volts) pendant 45 min à une heure (suivre le colorant).
3- Débrancher et colorer le gel en suivant les instructions fournies avec les gels.

Si une bande correspondant à une invertase inactive est détectée, on aura résolu le premier problème : la déficience dans l’utilisation du saccharose est liée à une anomalie dans la structure de l’invertase. Il restera à comparer allèle sauvage et allèle muté.

Si aucune invertase inactive n’est détectée, cela signifie que le défaut d’utilisation du saccharose est lié à l’absence de synthèse ou à l’absence d’exportation de l’invertase. Les protocoles suivants ont pour objet de tester ces hypothèses.

5. RECHERCHE D’UNE ANOMALIE DE BIOSYNTHESE OU D’EXPORTATION

5.1 Recherche d’un défaut général d’exportation des protéines

Objectif : détecter l'éventuelle absence de protéines exportées.

On utilisera une galerie API-ZYM (BIOMERIEUX) permettant de révéler d’éventuelles activités enzymatiques dans le milieu de culture.

Protocole

1- Incuber pendant 48 h à 35 °C en agitant doucement une colonie de levure sauvage et une colonie de levure SNF dans 100 mL de milieu complet.
2- Centrifuger et récupérer les surnageants.
3- Préparer quatre galeries API-ZYM (deux par souche) comme indiqué par le fabricant et charger les cupules des galeries avec le surnageant respectif des 2 cultures.
4- Incuber à 37°C et révéler les résultats des deux premières galeries au bout de 2 h, ceux des deux dernières après 4 h.

Si aucune enzyme exportable n’est détectée avec la souche sac- alors que diverses enzymes sont détectables avec la souche sauvage, c’est que l’ensemble du système de sécrétion est déficient. Si, au contraire, d’autres enzymes sont exportées, c’est que seule la voie de sécrétion de l’invertase est déficiente. Dans les deux cas, on recherchera de toute façon une activité invertase intracellulaire pour vérifier que seul un système d'exportation est en cause.


Galeries Api-Zym : résultats

5.2 Recherche d’une activité invertase intracellulaire

Objectifs : identifier la présence éventuelle de l’enzyme dans le milieu intracellulaire pour déterminer s’il existe un gène actif de l’invertase. Les principes mis en application sont similaires à ceux exposés ci-dessus (2.4) pour détecter une activité invertase extracellulaire.

Protocole

1- Mettre en suspension une colonie de la souche sac- et une colonie de la souche sauvage chacune dans 50 mL de milieu complet contenant 1 g de mannose et 5 mg de glucose comme sources de carbone.
2- Incuber 2 jours à 25°C.
3- Centrifuger la suspension de levures, éliminer le surnageant et broyer soigneusement le culot dans un mortier avec un peu de sable de Fontainebleau*. Ajouter 20 mL de tampon phosphate pH 4.6 et continuer à broyer.
4- Centrifuger et récupérer le surnageant.
5- Incuber 10 mL du surnageant avec 10 mL d’une solution de saccharose à 0.5 g/10 mL à 35°C pendant 20 minutes puis tester la présence de glucose avec une bandelette.

* On peut remplacer le broyage par un traitement enzymatique détruisant la paroi (lyticase).

Si le test s’avère positif, c’est qu’il existe bien un gène actif de l’invertase codant une enzyme active mais non exportée ce qui implique un défaut dans le seul système d’exportation de l’invertase. On recherchera alors si l’origine de ce défaut réside dans la séquence du gène de l’invertase en comparant la séquence du gène sauvage avec celle de l'allèle muté.

6. COMPARAISON DE LA SEQUENCE DES ALLELES

L’outil de comparaison de séquences utilisé est le logiciel SEQAID mis à disposition des établissements par l’INRP. Le même type d'activité peut être menée avec le logiciel ANAGENE distribué par le CNDP ou par n'importe quel autre logiciel de traitement de séquences.

Préparation des séquences relatives à l'invertase

La séquence du gène de l'invertase et la séquence polypeptidique de la protéine ont été téléchargées via Internet sur les serveurs spécialisés (PDB, YPD, SGDB etc.) puis intégrées à la base de données du logiciel SEQAID. La séquence du gène de structure, d'une part munie de la séquence signal, d'autre part dépourvue de cette séquence a servi pour construire les séquences des ARNm correspondants qui ont été ajoutées à la banque.

La séquence de l’invertase de la souche 288 C (souche de référence pour le séquençage du génome de la levure) est disponible dans les banques de données internationales et a été récupérée via Internet auprès de la Saccharomyces genome database puis intégrée à la base de données du logiciel SEQAID. S'agissant du même gène subissant une transcription alternative, il n'y a qu'une seule séquence pour les deux invertases.

Préparation des séquences signal

Les séquences signal de gènes correspondant à diverses souches SNF construites artificiellement par Kaiser & Botstein ont été tirées de la littérature (5) et après avoir été ajoutées au gène de structure de l'invertase, les séquences complètes ont été également transférées dans la banque de données du logiciel SEQAID.

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D.Pol, 1999

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