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OPTION SCIENCES EXPERIMENTALES : 
INVESTIGATIONS SUR UNE SOUCHE MUTANTE DE LEVURE

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Protocoles 
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Introduction

L’option sciences expérimentales en première S mise en place en 1993 est réservée à des activités scientifiques expérimentales. Compte tenu de la possibilité de mener des investigations étalées dans le temps dans un cadre plus souple que celui de l’enseignement commun, elle constitue un contexte idéal pour développer les capacités scientifiques des élèves en s’appuyant sur des activités diversifiées utilisant une grande variété d'outils scientifiques. A partir d’un problème précisément identifié, des hypothèses diverses peuvent être formulées puis mises à l’épreuve de l’expérience dans une démarche scientifique construite par les élèves eux-mêmes.

Parmi les cinq thèmes de biologie proposés dans cette option, celui intitulé Biologie des levures et utilisation des micro-organismes dans les industries de fermentation est massivement choisi. Les caractéristiques des levures, par ailleurs l'un des organismes modèles choisis par les chercheurs en génétique moléculaire, en font, en effet, un des organismes de laboratoire les plus pratiques à utiliser sur le plan pédagogique (1).

Pour les TP comme pour l’option sciences expérimentales, l’utilisation d’outils informatiques est clairement recommandée dans les instructions officielles (2). Outre l’ExAO aujourd’hui largement pratiquée au lycée (4), divers logiciels spécifiques issus de la recherche ont été mis à la disposition de l’enseignement, notamment par l’INRP et le CNDP, souvent pour des prix très bas comparativement aux logiciels proposés par les fournisseurs spécialisés. Il en est ainsi, par exemple, des logiciels de traitement de séquences de molécules informatives (3) et de ceux de visualisation tridimensionnelle de molécules. Aussi, leur utilisation se développe régulièrement, des stages de formation sont proposés et des exemples d’intégration dans une démarche scientifique et pédagogique sont régulièrement présentés et/ou publiés (4). Enfin, si de grandes quantités de données diversifiées sont déjà disponibles dans les banques fournies avec les logiciels diffusés, elles peuvent également être enrichies via Internet pour résoudre un problème scientifique ponctuel.

Ces considérations nous ont conduit à rechercher dans le cadre du thème sur la biologie des levures un problème biologique susceptible de favoriser la diversification des activités scientifiques proposées aux élèves car les levures se prêtent particulièrement à ce type d’approche combinant divers outils. Comme de multiples souches particulières sur le plan génétique sont disponibles auprès de chercheurs universitaires ou, pour un coût modique, dans le commerce spécialisé, divers problèmes biologiques peuvent être choisis dans le but de mener des investigations concernant les différents niveaux d’organisation du vivant depuis la population jusqu’au niveau moléculaire. Ce type de projet favorise en outre la coopération et la communication entre groupes menant des activités différentes conformément aux directives officielles (2).

Dans cette optique, nous avons proposé aux élèves du groupe option sciences expérimentales d’une classe de première S du lycée H. Wallon à Aubervilliers d’élaborer un projet de recherche destiné à résoudre un problème scientifique concernant une souche mutante de la levure Saccharomyces cerevisiae.

Ce document présente l’architecture de ce projet. On trouvera à la page des protocoles les détails techniques permettant de résoudre en classe les problèmes pratiques liés aux investigations proposées.

Le problème scientifique

La levure de boulanger, S. cerevisiae est un champignon unicellulaire aérobie facultatif capable de fermenter divers glucides (glucose et autres oses, diosides comme le maltose et le saccharose, oligosaccharides comme le raffinose). Toutefois, diverses souches mutantes sont inaptes à survivre sur un milieu contenant l’un ou l’autre de ces sucres comme seule source de carbone à l’exception du glucose que toutes les souches sont capables d'utiliser. Plusieurs souches mutantes incapables de fermenter le saccharose ont ainsi été isolées (souches SNF, sucrose non fermenting, appelées aussi sac-) et ont été étudiées en détail notamment dans le cadre de travaux de recherche sur les mécanismes d’exportation des protéines (5). Bien qu’elles conduisent toutes au phénotype sac-, diverses mutations ont été identifiées qui rendent les levures inaptes à utiliser le saccharose. La souche que nous avons choisie, fournie par la société SORDALAB, est la souche ATCC 56795 (American Type Culture Collection).

Le problème posé est le suivant :
comment s’explique, sur le plan génétique, l’incapacité de cette souche à fermenter le saccharose et donc à vivre sur un milieu contenant du saccharose comme seule source de carbone contrairement aux souches sauvages de S. cerevisiae ?
Ces dernières sont utilisées couramment, en enseignement commun ou en option, pour résoudre divers problèmes biologiques.

Prérequis

Les élèves ayant déjà étudié dans le programme commun les principes de la génétique moléculaire et ceux de la biosynthèse et de l’exportation des protéines, ils savent que si le défaut se maintient héréditairement dans la souche il est nécessairement d’origine génétique. Diverses causes pouvant expliquer l’incapacité à fermenter un sucre, il est donc d’abord demandé aux élèves de discuter entre eux pour passer en revue les différentes hypothèses explicatives qui peuvent être formulées puis d’élaborer les protocoles expérimentaux permettant de les mettre à l’épreuve lorsque c’est matériellement possible. Ils doivent expliquer les résultats attendus et leurs implications de façon à produire par écrit un plan d’expériences, véritable procédure d’organisation destinée à répartir le travail dans le temps, dans l’espace et entre les différentes équipes. Une séance est consacrée à cette introduction, le professeur aidant, le cas échéant, à la mobilisation des connaissances, à la réflexion ou à la mise en ordre.

Hypothèses formulées

L’étude de l’exportation des protéines en enseignement commun a permis aux élèves de constater que les levures synthétisent et sécrètent plusieurs enzymes, notamment des b -fructosidases, enzymes plus connues sous les noms d’invertase ou de saccharase. Ces enzymes sont d’une très grande importance industrielle car elles permettent la préparation industrielle de " sucre inverti " à partir du sucre de betterave. Elles catalysent l’hydrolyse du résidu b -D-fructofuranosyl terminal du saccharose et des oligosaccharides comme le raffinose. Les souches de levures communes peuvent utiliser le saccharose car elles sécrètent cette invertase dans le milieu de culture. En présence de cette enzyme, le saccharose présent dans le milieu est hydrolysé et les produits d’hydrolyse, glucose et fructose, sont absorbés par les cellules qui les utilisent comme substrats de la fermentation et de la respiration. La première hypothèse formulée découle de cette observation et elle génère plusieurs sous-hypothèses.

1. Les cellules de levure n’exportent pas d’invertase.

Une éventuelle absence de sécrétion de l’enzyme pourrait s’expliquer par deux raisons différentes :

1.1 Les cellules ne synthétisent pas du tout l’enzyme (défaut génétique dans le gène de l’invertase qui interromprait la biosynthèse de la protéine).

1.2 Les cellules synthétisent l’enzyme mais elles sont incapables de l’exporter (défaut du système d’exportation).

1.2.1 Il y a un défaut général des mécanismes d'exportation

1.2.2 Il y a un défaut dans le seul mécanisme d'exportation de l'invertase

Leurs connaissances sur les relations entre phénotype et génotype ont conduit les élèves à formuler une hypothèse alternative à l'hypothèse 1 :

2. Les cellules de levure exportent une forme inactive d’invertase (défaut génétique conduisant à une enzyme inactive).

A ce stade, le professeur n’intervient pas de façon à ne pas trop limiter les hypothèses possibles. En effet, la souche utilisée est parfaitement caractérisée et son défaut génétique est connu mais il paraît souhaitable de laisser les élèves formuler des hypothèses variées pour mener des investigations expérimentales diversifiées. En outre, d'autres souches de levure présentant le même défaut phénotypique en raison de défauts génétiques différents existent et peuvent être utilisées selon la même procédure voire comparées pour découvrir la cause génétique de leur incapacité à fermenter le saccharose.

A cette période de l’année (12/97), les élèves ont déjà une certaine expérience du travail avec les levures et sont familiarisés avec les principales techniques de la microbiologie. La souche étant régulièrement repiquée sur milieu solide au laboratoire, un petit nombre de colonies est disponible. Il est donc demandé aux élèves de cultiver au préalable la souche afin de disposer d’une quantité suffisante de levures pour les différentes expériences qu’ils seront amenés à mettre en oeuvre. Il est nécessaire de disposer à la fois de colonies en nombre suffisant pour certaines manipulations et de suffisamment de biomasse pour d’autres. Aussi, la souche sera repiquée sur milieu solide complet et sera multipliée en milieu liquide complet pour l’obtention de biomasse.

Les milieux sont préparés, autoclavés et coulés au laboratoire. Les ensemencements sont réalisés par les techniques classiques de la microbiologie qui ne seront pas décrites ici. En outre, il est demandé aux élèves de proposer des méthodes permettant de vérifier l’incapacité de la souche à fermenter le saccharose, cette vérification paraissant indispensable à la validité des travaux réalisés.

Activités pratiques et vérifications expérimentales proposées

1. Repiquage de la souche en milieu solide et multiplication en milieu liquide

Méthodes classiques de la microbiologie

2. Vérifications préliminaires ; incapacité à fermenter le saccharose.

Compte tenu du petit nombre de colonies à partir duquel sont repiquées les levures, il est indispensable de vérifier que la souche utilisée présente bien le caractère étudié. En effet, les levures ne sont pas à l’abri d’une mutation réverse (mutants " suppresseurs " par exemple). Trois tests sont réalisés pour cela : un test rapide de suivi de fermentation par ExAO, un test à long terme par culture sur milieu solide de façon à détecter une activité invertase qui se mettrait en place tardivement et un test avec des disques imprégnés de diverses sources de carbone pour comparer la croissance sur divers sucres incluant glucose et saccharose.

2.1 Mesure de la fermentation du saccharose par ExAO (mesure de la production de CO2 ou d’éthanol en présence de saccharose)

2.2 Culture sur milieu à base de saccharose contenant un indicateur de pH

2.3 Comparaison de la croissance avec différents substrats (méthode des disques)

Une fois vérifié le caractère SNF de la souche par ces trois méthodes, les hypothèses sont mises à l’épreuve de l’expérience.

3. Recherche de l’invertase dans le milieu de culture

L'hypothèse la plus simple permettant d’expliquer le caractère sac- de la souche est l’absence d’activité invertase extracellulaire qu’elle soit due à une forme inactive de l’enzyme ou à un défaut d’exportation. Un simple test correspondant à l’incubation du milieu de culture en présence de saccharose suivie de la détection du glucose éventuellement produit permet de tester cette hypothèse.

Le test s’avérant négatif, il est possible de passer aux vérifications suivantes.

4. Recherche d’une enzyme inactive dans le milieu de culture

La recherche d’un moyen de détecter une éventuelle enzyme inactive pose problème aux élèves car ils pensent ne connaître que des tests fondés sur l’activité enzymatique pour identifier l’enzyme. Après un passage en revue des méthodes d’étude des protéines utilisées dans de précédents TP on arrive à la conclusion que l’électrophorèse pourrait être envisagée puisqu’il s’agit de caractériser une protéine. Il faut alors disposer d’invertase pour identifier la protéine sur un électrophorégramme de milieu de culture et précipiter les protéines présentes dans le milieu de culture avant de les soumettre à l'électrophorèse. L'idéal serait une électrophorèse sur gel de polyacrylamide mais l'équipement nécessaire est rarement présent dans les lycées d'enseignement général. On lui a substitué une électrophorèse sur gel d'agarose utilisant des gels prêts à l'emploi sur support solide (MIDIGEL, BIOBLOCK SCIENTIFIC) qui s'adaptent aux cuves courantes.

Electrophorèse sur gel d’agarose

Piste 1 : invertase de levure (SIGMA)

Piste 2 : précipité des protéines du milieu de culture des levures.

Détection de l’invertase sur le gel d’électrophorèse

La détection d'une éventuelle invertase est faite par comparaison avec l'invertase du commerce. Si l’électrophorèse permet de détecter une bande correspondant à une invertase dans le milieu de culture de la souche déficiente, l'enzyme étant inactive, il faudra rechercher le(s) défaut(s) génétique(s) correspondant(s).

Si l’électrophorèse ne permet pas de détecter la présence d’une invertase inactive, ce qui est le cas avec la souche choisie, on recherche alors les défauts du système d'exportation des protéines.

5. Recherche d’une anomalie dans le système d’exportation de la protéine

Après élimination d’hypothèses peu réfléchies concernant des mécanismes généraux qui affecteraient la synthèse de toutes les protéines, on en arrive à l’idée que les mécanismes généraux d’exportation pourraient être déficients. Pour tester cette hypothèse il est décidé de vérifier dans un premier temps à l’aide de galeries (voir la carte des tests API ZYM) si la souche exporte d’autres protéines enzymatiques. En effet, si c’est le cas, cela signifie que l’anomalie d’exportation serait limitée voire spécifique de l'invertase. Dans le cas contraire c’est l’ensemble du système de sécrétion des protéines qui serait déficient. Dans le premier cas, l’invertase pourrait être " mal aiguillée " et rester intracellulaire. Elle devrait alors être synthétisée et on devrait pouvoir mettre en évidence une activité invertase intracellulaire.

5.1 Mise en évidence d’enzymes exportées

Les enzymes exportées sont mises en évidence avec une galerie API-ZYM permettant de tester diverses activités enzymatiques (phosphatases, protéases, glucosidases etc.).

Ce test s’avérant positif pour plusieurs enzymes, il s’agit ensuite de rechercher la présence d’une invertase intracellulaire.

5.2 recherche d’une activité invertase intracellulaire

Après broyage des cellules collectées par centrifugation, la recherche de l’activité invertase est réalisée par la détection du glucose éventuellement libéré après incubation du broyat en présence de saccharose. L'extrait cellulaire présentant une activité invertase, une protéine active est donc synthétisée mais n'est pas sécrétée.

Ainsi, si cette souche est inapte à utiliser le saccharose, c'est parce que l'invertase, synthétisée dans le cytoplasme n'est pas exportée.

A ce stade, une information doit être apportée aux élèves si l'on désire aller plus loin dans la résolution du problème c'est à dire jusqu'au niveau du gène et utiliser à cette fin les outils logiciels de traitement des données génétiques. En effet, chez la levure sac+, il existe deux invertases, une qui reste intracellulaire dont la fonction est inconnue, l'autre qui est sécrétée et rend possible l'utilisation du saccharose. C'est le même gène qui code les deux enzymes mais sa transcription diffère en fonction des signaux reçus par la cellule. Ainsi, en absence de glucose, l'ARNm qui est transcrit comporte une séquence nucléotidique de 63 paires de bases (pb) en amont du gène de structure. Cette séquence signal permet, lorsqu'elle est présente en tête du transcript, la translocation de la protéine correspondante vers la lumière du réticulum endoplasmique. Le transcript comporte cette séquence signal car la transcription débute 63 pb en amont du gène de structure. Lors de la traduction de l'ARNm comportant la séquence signal, l'enzyme passe dans les compartiments membranaires internes et le peptide correspondant est éliminé puis l'enzyme est glycosylée, emballée et exportée. En présence de glucose, la transcription commence au début du gène de structure et la protéine reste cytosolique en raison de l'absence de peptide signal. Il en résulte une protéine beaucoup moins glycosylée et non exportée. La transcription de la séquence signal est contrôlée par le niveau de glucose dans le milieu qui fait de l'enzyme exportée une enzyme inductible. L'invertase cytosolique est constitutive. La mutation responsable de l'absence de sécrétion de l'invertase dans la souche utilisée est située dans la séquence signal.

6. Etude génétique

Pour permettre aux élèves de poursuivre les investigations au niveau du gène avec les outils de traitement de séquences par ordinateur (logiciel SEQAID ou ANAGENE), une information restreinte leur est proposée :

Les levures sont capables de synthétiser deux invertases dont l'une est exportée, l'autre non. La structure primaire des deux invertases a été établie de même que la séquence des gènes et ARNm correspondants. On se propose de comparer les séquences pour identifier un éventuel défaut génétique. Pour cela, il est demandé d'abord de comparer ADN, ARNm et structure primaire respectifs des invertases et de faire la synthèse des observations. On aboutira ainsi à la notion de séquence régulatrice, ici la séquence signal.

Une fois cette notion établie, il est proposé aux élèves de comparer les séquences des deux gènes précédents avec celles obtenues chez différentes souches sac- dans le but d'identifier les défauts génétiques éventuels.

6.1 Comparaison invertase exportée - invertase intracellulaire

Activités des élèves

Les séquences proposées à l'étude étaient donc :

  • Structure primaire de l'invertase exportée et structure primaire (identique) de l'invertase cytosolique.
  • Séquence du gène.
  • Séquence de l'ARNm de l'enzyme exportée.
  • Séquence de l'ARNm de l'enzyme non exportée.
Au cours de cette étude, on attend des élèves :
  • l'identification d'une courte séquence (21 acides aminés) transcrite dans le cas de l'enzyme exportée mais n'apparaissant pas dans sa structure primaire, séquence non transcrite dans le cas de l'enzyme intracellulaire.
  • La formulation d'hypothèses sur la fonction de la séquence identifiée.

  • Pour tester les hypothèses, on propose la comparaison des gènes d'une souche sauvage et de diverses souches SNF construites artificiellement (5).

    6.2 Comparaison des séquences signal

    Activités élèves

    La comparaison des séquences d'ADN montre que chaque souche SNF présente une anomalie dans la séquence signal.

    Ainsi, le caractère SNF de la souche étudiée est lié à un défaut génétique affectant non le gène de structure lui-même mais une séquence régulatrice qui n'apparaît pas dans la protéine native. Cette séquence sert à "marquer" la protéine qui peut être alors dirigée vers le système d'exportation contrairement à son homologue cytosolique qui ne la possède pas.

    On peut d'autre part envisager de rechercher la nature (polaire, hydrophobe etc.) des acides aminés de la séquence signal pour la mettre en relation avec la perte de la capacité à exporter l'invertase et/ou construire des modèles tridimensionnels des séquences signal pour y rechercher d'éventuelles particularités de structure de la séquence fonctionnelle.

    Enfin, selon les souches, plusieurs gènes différents situés sur des chromosomes différents existent. Il est possible de rechercher d'éventuelles similitudes obligatoires dans les séquences signal fonctionnelles.


    Bibliographie

    1- Pol D. Travaux pratiques de biologie des levures. Ellipses, 1996
    2- Bulletin officiel du ministère de l’éducation nationale. Hors série, 24/09/1992
    3- Hervé J-C. & coll. Analyse de séquences de gènes et de protéines avec le logiciel SEQAID II. INRP, 1994
    4- Duval J-C. & Salamé N. (éd.) Informatique et communication dans l’enseignement des sciences de la vie et de la Terre.INRP, 1997
    5- Kaiser C.A. & Botstein D. Secretion-defective mutations in the signal sequence for Saccharomyces cerevisiae invertase. Molecular and cellular biology, vol 6, N°7, july 1986.



    Approvisionnement en levures SNF

    SORDALAB
    15 avenue des Grenots
    91150 ETAMPES
    FRANCE
    Téléphone :
    01.69.92.26.72
    Fax :
    01.69.92.26.74
    sordalab@wanadoo.f

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