Halobacterium salinarum, une archéobactérie extrêmophile pour aborder concrètement  le  troisième domaine du vivant
Article publié dans Biologie-Géologie, N°1, 2008

Résumé

Cet article présente Halobactérium salinarum, une archéobactérie extrêmophile qui colonise des milieux aquatiques dont la concentration en chlorure de sodium est proche de la saturation et où la plupart des autres organismes ne peuvent survivre. Outre son étonnante résistance au sel, à la dessiccation et au rayonnement ultraviolet, ce représentant des halobactéries présente un mode de vie caractérisé par des voies métaboliques variées incluant respiration aérobie et anaérobie, phototrophie et fermentation, qui lui confèrent d’exceptionnelles capacités d’adaptation. La diversité des problèmes biologiques qu’il permet d’explorer, alliée à la facilité de sa culture et de sa manipulation au laboratoire, à l’absence de risque de contamination des milieux de culture par d’autres microorganismes et à son innocuité pour l’homme en font un organisme remarquable pour mener des activités scientifiques variées en classe.


Introduction
Au cours des années 1970, le biologiste Carl Woese, professeur à l’université de l’Illinois (USA), entreprit de mesurer les parentés évolutives entre les organismes en comparant la séquence nucléotidique des gènes codant l’ARN 16 S des ribosomes. Cette molécule fut choisie parce qu’elle présente plusieurs caractéristiques intéressantes pour l’établissement de phylogénies moléculaires : elle est abondante ; elle est probablement très ancienne ; elle est universelle, puisque codée par les chromosomes des bactéries et des eucaryotes et par l’ADN des organites comme les mitochondries et les plastes ; elle est essentielle pour les cellules, où elle intervient au sein du ribosome dans la biosynthèse des protéines et elle interagit avec plus d’une centaines d’autres molécules d’ARN et de protéines avec lesquelles elle a coévolué ; elle possède des régions à évolution lente, d’autres à évolution rapide ; elle a globalement peu évolué, probablement en raison de son caractère « stratégique » pour la vie des cellules. Ces travaux lui permirent de découvrir, en 1977, que les bactéries productrices de méthane, dites méthanogènes, qui vivent pour certaines dans les eaux, mais aussi, pour d’autres, en symbiose dans l’intestin des termites et dans le rumen des ruminants, constituent un ensemble d’êtres vivants à part. Elles se distinguent en effet radicalement des bactéries que l’on connait depuis les travaux de Pasteur et de Koch, au dix-neuvième siècle, par des caractéristiques biochimiques et génétiques particulières. Il proposa le terme d’archaebacteria pour les qualifier, par opposition aux bactéries « ordinaires » qu’il proposa d’appeler dès lors eubacteria. Sur la base des séquences des ARN 16 S, d’autres archéobactéries vivant dans divers milieux extrêmes, extrêmement salés (Mer Morte, marais salants), extrêmement chauds (sources chaudes d’origine volcanique), extrêmement acides, etc., qualifiées respectivement d’halophiles extrêmes, de thermophiles extrêmes, d’acidophiles, etc. furent identifiées au cours des années suivantes. On donna alors le nom général d’extrêmophiles à ces organismes de l’extrême, mais on se rendit compte rapidement que tous les extrêmophiles ne sont pas des archéobactéries et que toutes les archéobactéries ne vivent pas dans des environnements extrêmes.

De nombreuses espèces d’archéobactéries extrêmophiles sont très délicates à cultiver en raison des difficultés à maintenir leurs conditions de vie au laboratoire et bien d’autres ne sont connues qu’indirectement par de l’ADN découvert dans divers milieux sans qu’on ait réussi à les cultiver. En revanche, plusieurs espèces d’halophiles extrêmes, des bactéries qui ne peuvent survivre que dans un milieu dont la concentration en chlorure de sodium est très élevée, peuvent être aisément cultivées au laboratoire. Elles présentent l’intérêt de pouvoir être utilisées par les élèves, sans risque de contamination du milieu par d’autres micro-organismes et donc sans danger, en raison justement de la concentration extrême en sel qu’aucun autre organisme ne peut supporter. On a ainsi l’opportunité de se pencher de manière concrète, en classe, sur les problèmes posés par les archées. Ajoutons que l’on peut s’en procurer aisément dans la nature, par exemple dans les marais salants, ou pour un faible coût dans le commerce.

Cet article a pour objet de présenter les caractéristiques exceptionnelles de l’espèce Halobacterium salinarum, un représentant des Halobactériacées, une famille d’archéobactéries halophiles extrêmes, dont la souche Halobacterium sp NRC1 est devenue un organisme modèle pour les biologistes depuis que son génome a été séquencé en 2000. Il propose également des exemples de la diversité des activités scientifiques concrètes auxquelles ces microorganismes peuvent donner lieu dans le cadre des programmes de l’enseignement secondaire et d’autres suggestions d’utilisation, compte tenu de la facilité de leur culture au laboratoire.

Caractéristiques des archées et phylogénie

Ce ne sont pas seulement les comparaisons de séquences des ARN 16 S qui ont conduit à réunir les êtres vivants en trois grands domaines distincts, les eubactéries, les archées et les eucaryotes. Bien d’autres caractéristiques, dont nous ne citerons que quelques-unes, plaident en faveur de cette hypothèse. Une des caractéristiques uniques des archées est la nature de leurs phospholipides membranaires qui n’existent ni chez les eubactéries, ni chez les eucaryotes. Alors que les phospholipides membranaires des eubactéries, comme ceux des eucaryotes, sont constitués de glycérol et d’acides gras reliés par des liaisons esters (glycérides), les phospholipides des archées sont constitués de glycérol et de chaînes ramifiées dérivées de l’isoprène, reliés par des liaisons éther (archaéol). L’un de ces dérivés de l’isoprène, commun chez les archées, est le phytanol, une molécule à 20 carbones. Ces lipides jouent un rôle important dans les environnements extrêmes où vivent souvent les archéobactéries car ils rendent la membrane moins perméable aux ions et plus résistante aux températures extrêmes ou aux concentrations élevées en sel.
Chez les bactéries qui possèdent une paroi, cette dernière contient un peptidoglycane complexe appelé muréine, polymère de dérivés aminés du glucose (N-acétylglucosamine et acide N-acétylmuramique) et de peptides comportant, notamment, des acides aminés de la série D qui n’existent pas dans les protéines où l’on ne trouve que des acides aminés de la série L. La muréine n’existe, ni chez les eucaryotes, ni chez les archées. Lorsque des archées possèdent une paroi, celle-ci peut comporter un polymère complexe, la pseudomuréine, mais cette dernière ne comporte aucun acide aminé de la série D. Chez d’autres archées, la paroi comporte des polysaccharides complexes similaires aux chondroïtines sulfates que l’on trouve dans les tissus conjonctifs des animaux. Enfin, chez d’autres, notamment chez Halobacterium, il existe une enveloppe formée uniquement de glycoprotéines, doublant la membrane plasmique. Les différences de constitution chimique des parois expliquent que, contrairement à de nombreuses eubactéries, les archéobactéries ne sont jamais sensibles au lysozyme, enzyme qui détruit la paroi bactérienne, ni aux antibiotiques de la famille des bêta-lactamines, comme la pénicilline, qui inhibent sa formation.

Toutes les cellules eucaryotes possèdent un cytosquelette comportant de la tubuline et de l’actine alors que les eubactéries et les archées sont dépourvues de cytosquelette comparable, même si elles possèdent quelques homologues très éloignés de la tubuline et de l’actine.

Enfin, les archées partagent certains caractères avec les eubactéries, comme l’existence d’un chromosome circulaire et parfois de plasmides, mais elles semblent plus proches des eucaryotes par la remarquable ressemblance de plusieurs macromolécules et mécanismes impliqués dans la réplication, la transcription et la traduction de l’information génétique.

La découverte de ces caractéristiques particulières, partagées par un vaste groupe de bactéries, bouleversèrent la vision que l’on se faisait de l’arbre phylogénétique du vivant il y a une trentaine d’années. Aujourd’hui, la majorité des biologistes s’accorde sur l’existence de trois branches principales du vivant, les eubactéries, les archéobactéries et les eucaryotes. Ces trois branches principales seraient issues d’un hypothétique « LUCA » (last universal common ancestor, c'est-à-dire « dernier ancêtre commun universel ») apparu il y a quelque 3,5 milliards d’années et l’ensemble des êtres vivants, passés et actuels, en descendraient. Si les relations phylogénétiques entre ces trois lignées principales, notamment le caractère monophylétique ou non des archées et les transferts horizontaux de gènes entre les lignées restent un sujet de discussion, voire de controverse, comme c’est habituel et fécond en sciences, la découverte des archées a entraîné de nombreuses recherches à l’origine de résultats extrêmement riches et souvent surprenants.

Figure 1 : les trois domaines du vivant (d’après Peer Bork et coll. EMBL , 2006)
En vert : archéobactéries ; en rouge : eucaryotes ; en bleu : eubactéries.


Le monde des archées comporte une extraordinaire variété de microorganismes, tant sur le plan physiologique que sur celui des modes de vie et les passer en revue n’est pas le but de ce travail. Nous nous limiterons ici à Halobacterium salinarum dont le double avantage est d’avoir donné lieu à une multitude de travaux scientifiques et de se prêter sans difficulté à une utilisation pédagogique. Il faut noter que la nomenclature des espèces a varié au cours du temps en raison de leurs caractéristiques physiologiques éminemment variables, comme on le verra. Depuis l’avènement de la génomique, différentes dénominations précédentes ont été regroupées désormais en une seule espèce Halobacterium salinarum, les études de génomique et de protéomique s’étant concentrées sur la souche NRC1.

Écologie des halophiles extrêmes

H. salinarum est une espèce représentative d’un vaste groupe, la famille des halobactériacées, dont une vingtaine de genres différents, comportant une cinquantaine d’espèces, ont été décrits. Les cellules de Halobacterium ont la forme de bâtonnets de 2 à 6 µm de long et de 0,4 à 0,7 µm de diamètre, munis de flagelles à une ou aux deux extrémités. En raison de leur taille, elles sont donc difficiles à observer au microscope optique, même s’il est possible de les voir avec un objectif à immersion comme le montre le cliché ci-dessous.


Figure 2 : cellules de Halobacterium salinarum
(microscope optique, état frais, X 630)

Les cellules sont limitées par une membrane formée de lipides typiques des archées, comme on l’a vu, et de protéines. Elles sont de plus enveloppées par une pellicule extramembranaire, appelée couche S, formée de glycoprotéines reliées par des ions Mg2+. Ces archéobactéries se développent dans des milieux contenant une concentration extrêmement élevée en chlorure de sodium, près de dix fois celle de l’eau de mer (de 3,5 à 5 Mol.L-1, soit plus de 290 g/L !), donc proche de la saturation (qui intervient vers 5,2 Mol.L-1, environ 300 g/L). On parle de milieu hypersalé dès que la concentration en sels totaux dépasse celle de l’eau de mer, c’est à dire lorsqu’elle est supérieure à environ 35 g/L.

On trouve ainsi des halophiles extrêmes dans les marais salants, dans la Mer Morte, dans divers lacs salés, comme le Grand Lac Salé à l’ouest des États-Unis et elles y forment souvent des nappes de couleur rouge dans lesquelles on peut trouver jusqu’à 100 millions de cellules par millilitre. On peut en trouver  aussi dans des mares salées temporaires au bord de la mer, mais aussi dans la saumure et dans diverses salaisons où elles forment des taches rouges, par exemple sur la morue salée contaminée. Quelques-unes sont également alcaliphiles avec une croissance optimale à pH 9,5 à 10.  Enfin, il existe aussi des espèces adaptées aux eaux froides que l’on a isolées des eaux profondes à salinité élevée de lacs de l’Antarctique.

Dans les bassins des marais salants, on observe une répartition spatio-temporelle précise des espèces halotolérantes et halophiles en fonction de la salinité et d’autres facteurs environnementaux (lumière, température). Il s’y produit ainsi une succession caractéristique d’espèces lorsque la salinité augmente lors de l’évaporation de l’eau et depuis les faibles concentrations (< 1 mol.L-1) aux fortes concentrations, jusqu’à la cristallisation du sel, divers microorganismes se succèdent, parmi lesquels des cyanobactéries, des protozoaires, des algues vertes et des archéobactéries halophiles. Mais lorsque la concentration atteint 4 mol.L-1 et continue à augmenter jusqu’à la saturation, seules les halophiles extrêmes peuvent se maintenir en vie et on ne trouve plus que Halobacterium. La concentration optimale pour sa croissance est de 4,6 mol.L-1.

Pour la plupart des cellules, la pression osmotique due à une forte concentration en sel est incompatible avec leur survie car le sel « pompe » littéralement l’eau intracellulaire. L’homme a d’ailleurs appris très tôt, semble-t-il, à utiliser cette propriété pour conserver des aliments à l’aide de saumure ou de salaisons. Quelques organismes sont cependant halotolérants car ils sont pourvus de divers mécanismes permettant d’empêcher la fuite d’eau. À l’inverse, Halobacterium a un besoin absolu d’une concentration élevée en sel, en particulier pour maintenir la structure de sa membrane, et ne peut se multiplier si la concentration en sel est inférieure à 2,5 mol.L-1. Si la concentration devient inférieure à environ 1,5 mol.L-1, les cellules éclatent.

La résistance des halobactériacées à une concentration élevée en sel s’explique par leur capacité à équilibrer la pression osmotique du milieu intracellulaire par rapport à celle du milieu extracellulaire par une concentration interne en cations particulièrement élevée. Elles accumulent les ions potassium (K+) dans leur milieu intracellulaire à des concentrations de l’ordre de 4 mol.L-1  et même, chez Halobacterium,  proche de 5 mol.L-1. La concentration intracellulaire en ions sodium est beaucoup plus faible. Elles accumulent aussi activement les ions chlorures. Cette accumulation dépend de protéines transmembranaires (canaux potassium, canaux chlorures) dont l’une est une pompe à chlorures activée par la lumière, appelée halorhodopsine, dont nous reparlerons plus loin.
La résistance d’Halobacterium à la dessiccation est stupéfiante et peut être aisément testée en classe. Lorsque quelques millilitres d’une culture en milieu liquide sont abandonnés dans un récipient, l’évaporation aboutit rapidement à la cristallisation du sel qui prend une teinte rougeâtre en emprisonnant les cellules bactériennes, comme le montre le cliché de la figure 3. Ces cristaux peuvent être conservés très longtemps à l’abri de l’humidité et être utilisés pour ensemencer des milieux de culture et redonner naissance à des colonies bactériennes. Soit les cristaux sont dissous dans du milieu de culture liquide et une goutte du liquide est prélevée pour être étalée sur milieu solide, soit les cristaux sont déposés directement à la surface du milieu. Dans les deux cas, après une semaine de culture à 37°C ou deux semaines à température ambiante, on voit apparaître les colonies roses typiques de la bactérie, démontrant ainsi leur exceptionnelle capacité de résistance à la dessiccation et au sel.



Figure 3 : cristaux de sel emprisonnant des cellules de H. salinarum
Noter la coloration rouge des cristaux due aux bactéries emprisonnées dans le sel
Figure 4 : paquets de colonies 10 jours  après le dépôt de quelques cristaux de sel de la figure 3 à la surface d’un milieu de culture solide placé à 35°C.

Certains chercheurs affirment même avoir isolé des halophiles extrêmes de dépôts salins provenant de couches géologiques très anciennes, mais ces travaux restent encore sujets à controverse.

Un métabolisme énergétique multimodal

H. salinarum présente un métabolisme énergétique lui permettant d’utiliser des sources d’énergie variées. Fondamentalement, c’est un chimioorganotrophe aérobie : il dégrade des substrats organiques en produisant de l’ATP par respiration aérobie, c’est à dire avec le dioxygène comme accepteur final du pouvoir réducteur (H+ + électrons) arraché aux substrats au cours du cycle de Krebs. La chaîne de transport des électrons, située dans la membrane plasmique, est constituée d’enzymes qui sont proches, sur le plan phylogénétique, de celles des eubactéries aérobies et les gènes qui les codent pourraient avoir été acquis par transfert horizontal à partir d’eubactéries. Dans la nature, les substrats organiques que ces bactéries utilisent comme source d’énergie, peptides, acides aminés, acides organiques, etc. proviennent généralement de la dégradation d’organismes moins halophiles qui meurent lorsque la salinité augmente excessivement. C’est pourquoi, on les cultive au laboratoire sur un milieu enrichi en substances organiques par de l’extrait de levure et de la peptone.

Mais Halobacterium a aussi une capacité de respiration anaérobie facultative. Dans ce cas, l’accepteur final des électrons est le DMSO (diméthylsulfoxide) ou la TMAO (triméthylamine N-oxyde). En outre, Halobacterium est également capable de fermenter l’arginine en la dégradant en ornithine, CO2 et NH4+ et sa membrane plasmique comporte d’ailleurs un système de transport couplant l’entrée de l’arginine à la sortie de l’ornithine.

Enfin, lorsque la concentration en oxygène moléculaire est faible, Halobacterium peut aussi devenir phototrophe, c’est à dire capable de produire de l’ATP en utilisant l’énergie lumineuse. Mais ce mécanisme n’a rien à voir avec la photosynthèse puisqu’il ne nécessite ni chlorophylle, ni bactériochlorophylle. La phototrophie de Halobacterium dépend d’une protéine membranaire, appelée bactériorhodopsine, dont le maximum d’absorption se situe dans le visible à 560 nm, c'est-à-dire dans le vert, contrairement aux chlorophylles qui n’absorbent pas dans cette région du spectre lumineux. À la lumière, en l’absence d’oxygène dissous, les voies métaboliques conduisant à la synthèse de la bactériorhodopsine sont stimulées.
Les molécules de bactériorhodopsine sont organisées en trimères qui forment dans la membrane un arrangement paracristallin bidimensionnel de forme hexagonale et lui confèrent une couleur pourpre alors que le reste de la membrane, siège de la respiration, est rouge en raison de la présence de caroténoïdes. En pompant activement les protons intracellulaires vers l’extérieur à travers la membrane sous l’action de l’énergie lumineuse, la bactériorhodopsine rend le milieu intracellulaire 10 000 fois plus alcalin que le milieu extracellulaire. Le gradient chimiosmotique ainsi produit à la lumière est utilisé par une ATP synthase membranaire pour synthétiser l’ATP à partir de l’ADP et du phosphate. Il a été calculé que la synthèse d’une molécule d’ATP nécessite l’absorption d’environ 22 photons.

L’incorporation de la bactériorhodopsine dans des liposomes a permis, en 1974, de démontrer in vitro, non seulement la réalité du pompage actif d’ions H+ par la bactériorhodopsine à travers la membrane sous l’action de la lumière, mais aussi la réalité de la photophosphorylation, puisqu’en ajoutant une ATP synthase mitochondriale à ces liposomes, il se forme de l’ATP en présence d’ADP et de phosphate. Cette expérience a magistralement validé l’hypothèse de Mitchell sur la production d’énergie dans les cellules par couplage chimiosmotique, théorie pour laquelle il reçut le prix Nobel de chimie en 1978.

Il faut aussi noter que la bactériorhodopsine ressemble à bien des égards à la rhodopsine, le pigment photorécepteur présent, notamment, dans la rétine des vertébrés et dans les yeux de nombreux insectes où il assure la transduction des signaux lumineux en signaux nerveux. Comme la rhodopsine, la bactériorhodopsine est constituée d’une protéine, l’opsine, associée à un chromophore assurant la photoréception. Ce dernier est un dérivé de caroténoïde, le rétinal, aldéhyde de la vitamine A. L’opsine comporte sept hélices transmembranaires et le rétinal lui est lié par l’intermédiaire d’une lysine (216) de la septième hélice. Comme dans la rhodopsine, le rétinal change de conformation quand il absorbe l’énergie des photons et permet ainsi la perte d’un proton par la protéine. Toutefois, le changement de conformation du rétinal induit par la lumière (de trans à cis) est l’inverse de celui qui se produit dans la rhodopsine rétinienne (de cis à trans). La séquence complète des acides aminés de la bactériorhodopsine a été élucidée et sa structure tridimensionnelle établie.


Figure 5 : modèle tridimensionnel de la bactériorhodopsine
Noter les sept hélices transmembranaires et le rétinal (représenté en boules rouges)

Le fichier PDB de la bactériorhodopsine peut être téléchargé à l’adresse ci dessous pour être utilisé avec les logiciels Rasmol ou Rastop ou directement dans un logiciel de navigation pourvu qu’il soit équipé de l’application (plug-in) Chime :
http://www.pdb.org/pdb/explore.do?structureId=1FBB

D’étonnantes capacités d’adaptation

Les milieux dans lesquels vit Halobacterium (marais salants, mares temporaires en bord de mer, Mer Morte, etc.) sont généralement exposés à un rayonnement solaire intense et particulièrement défavorables pour un organisme fondamentalement aérobie parce qu’une extrême concentration en sel et une température élevée sont deux facteurs qui diminuent fortement la solubilité de l’oxygène moléculaire dans l’eau. En outre, la disponibilité en substrats organiques y est très variable et elle diminue fortement lorsque la population est dense, tout comme la disponibilité du dioxygène, d’ailleurs. Halobacterium a développé d’étonnantes capacités d’adaptation qui lui permettent de profiter au mieux des divers types de métabolismes dont elle dispose pour faire face à ces contraintes majeures.

Outre la bactériorhodopsine, Halobacterium possède d’autres rhodopsines à structure tridimensionnelle comparable dont les séquences comportent de nombreuses homologies. On les regroupe sous le nom d’archéorhodopsines. On a déjà cité l’halorhodopsine qui pompe activement vers le milieu intracellulaire les ions chlorures sous l’action de la lumière, ce qui, en termes de potentiel transmembranaire, est équivalent au pompage de protons vers le milieu extracellulaire avec, toutefois, une moins bonne efficacité sur le plan énergétique. Halobacterium est capable de détecter les variations de pression osmotique, de température, de concentration en dioxygène, mais aussi diverses substances chimiques. Elle possède deux rhodopsines à fonction sensorielle (sensorirhodopsines) qui lui permettent de détecter différentes longueurs d’onde de la lumière.

Les cellules de Halobacterium sont mobiles par l’intermédiaire de deux types de structures. Elles possèdent des flagelles leur permettant de nager activement, mais aussi des vacuoles gazeuses intracellulaires, limitées par une simple couche de protéines, leur permettant de remonter vers la surface, là où la concentration en dioxygène dissous est la plus élevée. Ces vacuoles pourraient aussi jouer un rôle dans la répartition verticale de la population. Le fonctionnement des flagelles est en relation, par des systèmes de signalisation intracellulaire, avec les différentes molécules capables de détecter les conditions de milieu. Ainsi, de multiples transducteurs membranaires sont sensibles à une large variété de signaux chimiques (O2, acides aminés, peptides, etc.) et en transmettant l’information aux flagelles permettent aux bactéries de nager vers les molécules utiles. Ceci peut être montré expérimentalement. On ensemence avec des cellules bactériennes une boîte de Pétri contenant du milieu faiblement gélosé (0,25 %, pour ne pas gêner les déplacements des cellules) et on mélange bien l’ensemble de façon à disperser les cellules dans toute la boîte. On place alors un fragment de bouillon de viande concentré en cube dans le milieu et on abandonne la culture après avoir recouvert la boîte de papier d’aluminium pour empêcher l’action de la lumière qui pourrait interférer avec les déplacements des cellules. Quelques jours plus tard, les cellules se sont concentrées autour du bloc de bouillon qui a libéré des peptides et acides aminés attractifs pour Halobacterium (voir figure 5). Des expériences plus précises peuvent aussi être réalisées en utilisant à la place du bouillon en cube, des petits blocs de gélose à 2 % contenant un acide aminé à la concentration de 50 mMol.L-1. Les acides aminés attractifs pour Halobacterium sont l’arginine, la leucine, l’isoleucine, la valine, la méthionine et la cystéine. Divers dipeptides et tripeptides sont également attractifs. En revanche, les benzoates et les phénolates exercent un effet répulsif sur les cellules.


Figure 6 : Chimiotactisme chez Halobacterium.
Après quelques jours de culture, les cellules convergent
vers le bloc de bouillon concentré.

Par des mécanismes comparables, les rhodopsines sensorielles photosensibles confèrent à Halobacterium un phototropisme, positif pour la lumière verte et négatif (phoborhodopsine) pour la lumière bleue et ultraviolette. Tous ces mécanismes permettent aux cellules de se déplacer vers les sources de substances organiques, de recevoir davantage d’énergie lumineuse pour assurer la photophosphorylation bactériorhodopsine – dépendante, de se rapprocher des couches superficielles où la concentration en dioxygène dissous est plus élevée ou, au contraire, de s’éloigner de la surface lorsqu’il y a trop de rayonnement UV.
L’existence des vacuoles gazeuses peut être démontrée indirectement. Lorsqu’on abandonne un tube de culture, les cellules remontent en masse vers la surface en quelques jours (voir cliché 1, figure 7) et on observe alors un gradient croissant de concentration en cellules du bas vers le haut, comme le montre le cliché. On peut alors verser une partie de la culture dans un tube (en plastique, par précaution), ce qui a pour effet d’homogénéiser la suspension de cellules et d’uniformiser la turbidité (voir cliché 2, figure 7).
Après avoir fermé le tube avec un bouchon, en donnant quelques coups secs avec un marteau sur le bouchon, les vacuoles de gaz se dégonflent en raison de la surpression et, en quelques heures, les bactéries sédimentent au fond du tube (voir cliché 3, figure 7).
Si on les abandonne de nouveau quelques jours, les vacuoles gazeuses se regonflent et les bactéries remontent vers la surface. Le même résultat peut être obtenu par une simple centrifugation qui provoque également une surpression.


Figure 7 : mise en évidence des vacuoles gazeuses
1 : les vacuoles gazeuses font remonter les bactéries vers la surface où la densité de cellules est très élevée ;
2 : après avoir versé un échantillon de la culture dans un tube, la densité de cellules est homogène ;
3 : après une surpression provoquée, les cellules tombent vers le fond en raison du dégazage des vacuoles.


Ces bactéries peuvent aussi passer du métabolisme respiratoire aérobie à la phototrophie en augmentant la production de membrane pourpre par l’induction de la synthèse de bactériorhodopsine et des diverses enzymes nécessaires au métabolisme phototrophe. De plus, les diverses voies métaboliques sont coordonnées de telle sorte que, lorsque la bactérie produit son ATP par la fermentation de l’arginine, par exemple, la phototrophie est suspendue et, inversement, lorsqu’elle utilise l’énergie lumineuse, la fermentation est suspendue.
Tous ces mécanismes permettent à ces bactéries de s’adapter finement à des conditions souvent changeantes dans les milieux qu’elles occupent, qu’il s’agisse de la disponibilité en substances organiques, de la concentration en sel et en dioxygène, de la température, de l’intensité et de la qualité du rayonnement (lumière visible et ultraviolette).

Des mécanismes de réparation de l’ADN très efficaces

Le phototropisme négatif de ces bactéries est surprenant car elles sont beaucoup plus résistantes au rayonnement UV que la plupart des autres cellules. En effet, elles sont souvent entourées d’une pellicule de cristaux de sel et leur membrane contient des caroténoïdes protecteurs, en particulier de la bactériorubérine, un caroténoïde à 50 carbones, qui confère à la membrane une couleur rouge en dehors des régions riches en bactériorhodopsine qui, elle, est de couleur pourpre.


Figure 8 : modèle tridimensionnel de la bactériorubérine
(caroténoïde comportant 50 atomes de carbone)

H. salinarum possède en outre un génome beaucoup plus riche en G + C que en A + T, le rendant moins sensible à la formation de dimères de thymine et de multiples systèmes de réparation de l’ADN très efficaces, notamment pour éliminer et remplacer les dimères de thymine qui se forment lorsque l’ADN absorbe l’énergie des UV. La résistance de ces bactéries aux UV est étonnamment élevée comme on le constate sur le graphique ci-après exprimant le pourcentage de survie de différentes espèces en fonction de la dose d’UV reçue.


Figure 9 : résistance au rayonnement
(d’après McCready et al. Saline Systems 2005 1:3)
Homme : fibroblastes humains

Comme le montrent les tracés, la résistance aux UV est beaucoup plus élevée à la lumière qu’à l’obscurité, ce qui traduit l’existence de systèmes de réparation de l’ADN dépendants de la lumière, un mécanisme de réparation appelé photoréactivation, déjà connu chez d’autres espèces de microorganismes, par exemple chez la levure. Les tracés montrent qu’une irradiation de 150 J/m2 est létale à 100 % pour la levure S. cerevisiae, alors que Halobacterium y résiste, à la lumière, avec un taux de survie de 80 %.
Seul Deinococcus radiodurans, une bactérie connue justement pour son extrême résistance aux rayonnements, y compris radioactifs, a un taux de survie supérieur (100 %) pour cette dose de rayonnement.
Divers caroténoïdes sont nécessaires aux systèmes de réparation de l’ADN et à la protection des cellules contre les dérivés actifs de l’oxygène, notamment l’ion superoxyde et le peroxyde d’hydrogène, susceptibles d’endommager l’ADN. Outre la bactériorubérine, Halobacterium synthétise divers caroténoïdes dont du bêta-carotène et du lycopène qui servent aussi d’intermédiaires dans la production du rétinal nécessaire au fonctionnement des diverses rhodopsines. Ceci explique qu’elle ne puisse vivre de manière prolongée en milieu anaérobie car le rétinal est produit par le clivage oxydatif du bêta-carotène qui nécessite de l’oxygène moléculaire.

Des protéines pour vivre dans le sel

Il convient de s’interroger sur les protéines présentes chez Halobacterium. En effet, comme on l’a vu plus haut, les cellules résistent à la forte concentration en NaCl extracellulaire en accumulant principalement du chlorure de potassium à des concentrations très élevées (de l’ordre de 5 mol/L). Si ce dispositif permet d’empêcher la fuite d’eau, il devrait cependant soumettre la cellule à un sévère stress salin car les protéines sont insolubles dans un milieu aussi concentré en sels. À cette concentration, la plupart des protéines précipitent et ne peuvent dès lors remplir leurs fonctions. En effet, la structure tertiaire des protéines qui conditionne leurs fonctions, est étroitement dépendante des interactions avec les molécules d’eau présentes à leur surface, ce que l’on appelle la couche d’hydratation. Aussi, lorsqu’une protéine soluble est placée dans une solution de NaCl ou de KCl proche de la saturation, les molécules d’eau piégées par le sel ne peuvent plus interagir avec les acides aminés présents à la surface de la molécule, entraînant ainsi la déstabilisation de la conformation native de la protéine qui devient insoluble et précipite.
Il est aisé de montrer l’action d’une forte concentration en sel sur une protéine soluble banale et abondante, l’albumine du blanc d’œuf de poule, pourtant particulièrement résistante à une concentration élevée en sel. Après avoir filtré un blanc d’œuf sur une gaze pour éliminer les chalazes, on complète le volume à 50 mL d’eau distillée et, avec un agitateur, on mélange doucement, sans faire de mousse, pour obtenir une solution homogène. Après avoir réparti quelques mL de cette solution dans deux tubes et en complétant le premier avec un excès de solution de NaCl à saturation et le second avec une solution de NaCl quelconque, on constate l’apparition d’un trouble dans le premier tube, traduisant la dénaturation de l’ovalbumine, tandis qu’il ne se passe rien dans le second. Après quelques heures, l’ovalbumine sédimente et forme un culot au fond du premier tube.



Figure 10 : action du sel sur une solution d’ovalbumine
En présence d’une solution saturée en sel, l’ovalbumine devient insoluble et précipite (tube à gauche, cliché 1). Elle sédimente ensuite au fond du tube (tube à gauche, cliché 2). Les tubes à droite sont des témoins (ovalbumine en présence d’une solution de NaCl inférieure à la saturation).

Ainsi, les protéines ordinaires, non halophiles, ne peuvent conserver leur structure tridimensionnelle qui assure leur solubilité dans l’eau lorsqu’elles sont placées dans une solution saturée en sel. La solution adoptée par les bactéries halophiles est de synthétiser des protéines qui concentrent près de 10 % de leur poids en KCl près de la surface de la molécule, ce qui permet d’y piéger les molécules d’eau nécessaires au maintien de leur configuration spatiale et à leur solubilité dans l’eau. La surface de ces protéines est en quelque sorte recouverte d’une pellicule formée de sels et d’eau qui les stabilise et, si la concentration en KCl devient insuffisante, elles se dénaturent. Elles ne peuvent donc pas fonctionner en l’absence d’une concentration élevée en sel : chez les bactéries halophiles extrêmes, ce sont les protéines elles-mêmes qui sont halophiles. En outre, ces protéines sont stabilisées par des ponts salins. Il en est de même pour les liaisons entre sous-unités des édifices protéiques à structure quaternaire.

La détermination de la séquence de plusieurs de ces protéines et l’établissement de leur structure tridimensionnelle par le calcul a montré qu’elles diffèrent de leurs homologues non halophiles par une grande abondance d’acides aminés acides (acides glutamique et aspartique) situés en surface, donnée confirmée par les résultats du séquençage du génome de Halobacterium et par l’établissement de la structure tertiaire de quelques protéines halophiles par cristallographie. Le point isoélectrique (pHi) moyen calculé pour les 2 630 protéines de Halobacterium prédites par le séquençage est d’environ 4,9 avec un pic à 4,2 alors que le pHi moyen des protéomes d’organismes non halophiles est proche de la neutralité avec une distribution bimodale correspondant à deux sous ensembles de protéines : acides (pHi proche de 5) et basiques (pHi proche de 10). Rappelons que le pHi est le pH pour lequel charges négatives et positives d’une protéine sont égales. Plus il est bas, plus la protéine contient une proportion élevée d’acides aminés portant une fonction acide supplémentaire et plus les charges électriques négatives de surface sont nombreuses, ce qui augmente l’affinité pour les cations. Cette caractéristique peut être aisément mise en évidence en comparant, avec les logiciels de la famille Rastop ou avec l’application Chime pour les navigateurs Internet, deux protéines homologues provenant, l’une, d’une bactérie halophile extrême, l’autre, d’une bactérie non halophile. Ces logiciels permettent de sélectionner des résidus particuliers, ici les acides glutamique et aspartique, et de les figurer différemment des autres par la forme et la couleur (voir figure 9). Pour les figures ci-après, une malate déshydrogénase de l’espèce Haloarcula marismortui, une halophile extrême proche de H. salinarum, et une enzyme homologue d’une espèce non halophile, la lactate déshydrogénase d’un lactobacille ont été choisies, mais diverses protéines, enzymes, facteurs de transcription ou autres peuvent être utilisées pour ce type d’activité si, toutefois, leur structure tridimensionnelle a été établie.



Lactate déshydrogénase de L. pentosus
Malate déshydrogénase de H. marismortui
Figure 11 : distribution des acides aminés acides à la surface de protéines homologues chez une bactérie non halophile (Lactobacillus pentosus) et chez une bactérie halophile (Haloarcula marismortui).
Les acides glutamique et aspartique sont figurés par les boules rouges

Le génome de Halobacterium
Le séquençage du génome a été mené sur une souche d’Halobacterium sp. appelée NRC-1. C’est le plus petit génome connu chez les halophiles avec un total de 2 571 010 paires de bases. Il comporte trois réplicons circulaires, dont un grand chromosome de 2 014 239 paires de bases, riche en guanine et cytosine (68 % de G + C), et deux plasmides, appelés pNRC100 et pNRC200, formés respectivement de 191 346 et 365 425 paires de base (58 – 59 % de G + C). Ces deux plasmides comportent 145 428 paires de bases en commun, notamment des séquences répétées inversées. Comme ils portent certains gènes essentiels au fonctionnement cellulaire (ADN polymérase, cytochrome oxydase, facteurs de transcription, etc.), on les considère davantage comme des minichromosomes que comme des plasmides.

La séquence complète du génome de Halobacterium sp. NRC-1 a été publiée en 2000. 2 630 gènes susceptibles de coder des protéines ont été identifiés, dont 972 sans équivalent dans les bases de données, ainsi que 52 gènes codant des ARN. 1 658 gènes codent des protéines dont les séquences comportent de nombreuses similitudes avec celles de protéines déjà présentes dans les bases de données. L’étroite ressemblance avec certaines protéines d’eubactéries et d’autres arguments ont conduit des chercheurs à suggérer que plusieurs gènes présents chez Halobacterium ont pu être acquis au cours de l’évolution par un transfert horizontal de gènes entre eubactéries et archées, expliquant les difficultés à établir la phylogénie moléculaire de ce microorganisme.

Le génome de Halobacterium est également connu pour son extrême instabilité. Celle-ci résulte notamment de la présence de 91 séquences d’insertion, des éléments transposables responsables de réarrangements du génome. Il s’agit de séquences susceptibles de s’insérer dans d’autres régions du génome, éventuellement au sein d’un gène dont elles empêchent ainsi le fonctionnement. Ces réarrangements sont responsables d’une importante variabilité phénotypique et la survenue de colonies mutantes est courante dans les boîtes de culture. On constate, par exemple, un taux spontané de mutations affectant la formation des vacuoles gazeuses (vac-) de quelque 10-2, ce qui est extrêmement élevé puisque le taux spontané de mutations est habituellement de l’ordre de 10-6 pour la plupart des cellules. D’autres mutations affectent la synthèse de la bactérioopsine ou celle des caroténoïdes, rétinal ou bactériorubérine. La plupart de ces mutations sont détectables par l’examen à l’œil nu des colonies obtenues en culture sur milieu solide car elles se manifestent phénotypiquement par des variations de la couleur des colonies. Après étalement sur milieu solide d’une dilution appropriée pour obtenir des colonies séparées, les bactéries de la souche sauvage, qui possèdent des vacuoles gazeuses, de la bactériorubérine et de la bactériorhodopsine, forment des colonies opaques, de couleur rose clair, car la couleur de la membrane due à la bactériorhodopsine (membrane pourpre) et à la bactériorubérine (membrane rouge) est légèrement masquée par la réfraction de la lumière due à la présence des vacuoles gazeuses. Les colonies issues de mutants dépourvus de vacuoles gazeuses sont plus ou moins transparentes. On observe aussi des colonies légèrement pourpres lorsque la mutation affecte la synthèse de la bactériorubérine ou tirant vers l’orange lorsque c’est la synthèse de la bactériorhodopsine qui est affectée. Enfin, on observe parfois des colonies présentant des secteurs de couleurs différentes dus à l’apparition de l’une ou l’autre de ces mutations au cours de la croissance de la colonie. En dehors de la mutation portant sur la production de vacuoles gazeuses dont la fréquence est, comme on l’a vu de l’ordre de 10-2, celles portant sur la synthèse de la bactériorubérine et de la bactériorhodopsine ont une fréquence de l’ordre de 10-4, ce qui reste très élevé pour des mutations spontanées.




Figure 12 : différents phénotypes résultant de mutations spontanées en culture sur milieu solide.
(loupe binoculaire X 10) Noter l’aspect et la couleur des colonies sauvages, les plus nombreuses

Pour identifier avec plus de certitude la nature des mutations obtenues, on peut remettre la colonie en culture en milieu liquide pendant quelques jours et, d’une part, vérifier si les cellules remontent vers la surface et, d’autre part, comparer le spectre d’absorption d’une suspension de cellules sauvages avec celui d’une suspension issue d’une colonie mutante. Dans le premier cas on pourra vérifier l’absence de vacuoles gazeuses, dans le second l’absence de tel ou tel pigment.
Rappelons que la multiplication de Halobacterium est lente, comparativement à celle d’autres microorganismes comme le colibacille ou même la levure et qu’il faut plusieurs jours pour obtenir une croissance significative d’une culture en milieu liquide même à la température optimale de 42°C. À température ambiante la croissance est évidemment beaucoup plus lente. Les caractéristiques génétiques de Halobacterium en font un organisme modèle particulièrement fécond en biologie moléculaire. De nombreux vecteurs plasmidiques peuvent y être introduits, des systèmes de remplacement de gènes ou de délétion ont été développés et divers marqueurs génétiques de sélection et de contre sélection sont disponibles. Des puces à ADN ont aussi été développées permettant d’identifier les gènes transcrits préférentiellement dans telle ou telle condition et donc d’identifier précisément vers quel type de métabolisme la bactérie oriente l’expression de son génome en fonction des conditions de milieu et d’étudier les mécanismes de régulation correspondants. C’est donc un organisme modèle particulièrement précieux pour étudier les relations entre génotype, environnement et phénotype et les régulations complexes qui les contrôlent. C’est aussi une source de d’applications biotechnologiques.

Applications biotechnologiques

Les travaux sur les halophiles extrêmes, notamment ceux portant sur la recombinaison génétique, sur les propriétés et les différents états de la bactériorhodopsine et des halorhodopsines, sur les enzymes halophiles, sur les vésicules gazeuses, etc. ont conduit au développement de diverses applications qui ont conduit à plus de 160 brevets dans des domaines variés : biopolymères, techniques de séparation, protection de documents officiels, mémoires holographiques, papier et encre électroniques, photodétection, enzymes, dépollution, production de caroténoïdes, etc. L’intérêt de ces microorganismes n’est donc pas limité au seul aspect fondamental dans les domaines de l’évolution et de l’écophysiologie des archées, mais s’étend aussi à des applications pratiques dans des domaines technologiques parfois inattendus.

 
Conclusion
Les archéobactéries halophiles, notamment H. salinarum, ont des caractéristiques uniques qui leur permettent de prospérer dans un environnement particulièrement hostile où aucun autre être vivant ne peut survivre. Certains chercheurs formulent même l’hypothèse que l’on pourrait trouver de tels êtres vivants emprisonnés dans des cristaux de sels sur la planète Mars si la vie y a été présente à une époque. Des expériences de l’agence spatiale européenne ont montré qu’une souche d’halophile extrême appartenant au genre Haloarcula, proche de Halobacterium, est capable de survivre plusieurs semaines dans l’espace sans aucune protection et ce type de bactérie pourrait donc être susceptible de voyager dans l’espace à bord de météorites contenant des cristaux de sel et, éventuellement, d’ensemencer ainsi d’autres corps célestes.
Quoi qu’il en soit, leurs capacités de résistance à divers facteurs extrêmes de l’environnement (dessiccation, concentration en sel, rayonnement ultraviolet, absence de dioxygène), leurs étonnantes capacités d’adaptation et la connaissance de leur génome font de ces archéobactéries un organisme modèle de choix. De plus, la facilité et la sûreté de leur culture, comme leur facilité de conservation à long terme, y compris au sein de cristaux de sel, permettent de mettre en œuvre des activités passionnantes pour aborder dans l’enseignement le troisième domaine du vivant, celui des archées, que l’on n’a pas souvent l’occasion d’explorer en classe et sur lequel on n’a, encore moins souvent, l’occasion d’expérimenter. Outre les quelques observations et expérimentations présentées précédemment, on trouvera en annexe d’autres suggestions d’utilisation en classe de ce remarquable représentant des archéobactéries.
 
Annexe

Quelques suggestions d’utilisation en classe

H. salinarum est particulièrement facile à cultiver puisque, même si les règles de travail en conditions stériles sont mal respectées lors des manipulations, les milieux ne risquent pas d’être envahis par des moisissures ou d’autres bactéries en raison de la concentration en sel. De plus, il n’est pas dangereux pour l’homme. C’est donc un organisme idéal pour apprendre les techniques de base de la microbiologie. Sur le plan pratique, un autre avantage est le temps de doublement des cellules qui est d’environ six heures à 37°C. Comme il faut environ 25 cycles cellulaires pour observer une colonie à l’œil nu à partir d’une cellule, il faut environ une semaine à cette température pour observer les colonies après la mise en culture sur milieu solide, ce qui évite aux élèves de surveiller quotidiennement leurs cultures. À température ambiante, il faut compter environ deux semaines, mais à la température optimale de culture, de l’ordre de 42°C, on peut obtenir des résultats en quelques jours.
Ces bactéries peuvent donner lieu à des activités diversifiées utilisant des outils variés. Le métabolisme peut être étudié à l’aide d’une sonde à oxygène ou d’un pH-mètre ; la croissance peut être suivie par turbidimétrie avec un colorimètre ou par étalement de dilutions sur milieu solide ; les pigments peuvent être étudiés par chromatographie ou, si l’on dispose d’un spectrophotomètre, en établissant le spectre d’absorption de la membrane, tant chez la souche sauvage que chez les différents mutants ou pour distinguer phototrophie et photosynthèse. H. salinarum se prête aussi à l’utilisation en classe des outils désormais classiques que sont Anagène et Rastop. Avec le premier, dans le cadre d’un travail sur l’évolution, on pourra comparer la séquence de l’ARN 16 S avec celles de divers organismes, celles des diverses rhodopsines de Halobacterium, ou encore celles de protéines homologues entre divers organismes ; avec le second, on pourra explorer les particularités de diverses protéines halophiles par rapport à leurs homologues non halophiles. Étant donné que, lorsqu’elles sont mises en présence d’eau, les cellules sont immédiatement lysées libérant leur contenu dans la solution, on peut aussi explorer l’activité de diverses enzymes (peroxydase, estérases) en fonction de la concentration en sel dans le milieu. Enfin, pour la même raison, l’extraction de l’ADN est particulièrement simple à réaliser. Après lyse des cellules par l’eau, les protéines précipitent en majorité et l’ADN reste en solution où on peut le faire précipiter par la méthode classique à l’éthanol glacial. Dissous dans un tampon adéquat, il peut être étudié par électrophorèse.

On peut se procurer Halobacterium salinarum  ainsi que les milieux de culture adaptés chez :

SORDALAB

Parc Sudessor
15 Avenue des Grenots
91150 ÉTAMPES
Téléphone : 01 69 92 26 72
Télécopie : 01 69 92 26 74
Web : www.sordalab.com

Des protocoles détaillés pour manipuler avec Halobacterium salinarum

Bibliographie :
Zaccaï J. & Franzetti B., Un pacte moléculaire avec le sel, La Recherche, 317, février 1999
Ng W. V. et al., Genome sequence of Halobacterium species NRC-1, PNAS, 2000, vol. 97, N°22
DasSarma  S., Extreme halophiles are models for astrobiology, Microbe, vol 1, 3, 2006
Sites Internet :
The HaloEd project :
http://halo.umbi.umd.edu/~haloed/
Halobacterium salinarum overview (Max Planck Institute) :
http://www.biochem.mpg.de/en/research/rd/oesterhelt/web_page_list/Org_Hasal/index.html
Encyclopedia of life sciences :
DasSarma  S. & DasSarma P., Halophiles, Encyclopedia of life sciences, 2006
http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/047001590X/home

TOUS DROITS RÉSERVÉS
Didier Pol © 2008
dpol#noos.fr

N'hésitez pas à faire connaître vos impressions, commentaires, suggestions etc