Isolement de mutants spontanés chez l'archéobactérie halophile Halobacterium salinarum


Autres activités et protocoles avec H. salinarum :

Introduction

La séquence complète du génome de l'espèce Halobacterium sp. NRC-1 a été publiée en 2000. 52 gènes codant des ARN et 2 630 gènes susceptibles de coder des protéines ont été identifiés, dont 972 sans équivalent dans les bases de données et 1 658 comportant des similitudes avec des protéines déjà connues. Divers travaux suggérent que plusieurs des gènes de Halobacterium présentant des similitudes avec des gènes d’eubactéries ont pu être acquis au cours de l’évolution par un transfert horizontal, c'est à dire par transfert interspécifique.
Le génome de Halobacterium sp. NRC-1 est le plus petit génome connu chez les halophiles avec un peu plus de 2,5 millions de paires de bases. Il comporte trois unités circulaires, un grand chromosome riche en guanine et cytosine, et deux plasmides, appelés pNRC100 et pNRC200.
Le génome de Halobacterium est particulièrement instable parce qu'il comporte notamment des éléments transposables, séquences susceptibles de s’insérer dans d’autres régions du génome. Lorsqu'ils s'insèrent au sein d’un gène, ils en bloquent le fonctionnement. Ces réarrangements spontanés sont responsables d’une importante variabilité phénotypique et la survenue de colonies mutantes est courante dans les boîtes de culture. On constate, par exemple, un taux spontané de mutations affectant la formation des vacuoles gazeuses (vac-) de quelque 10-2, ce qui est extrêmement élevé puisque le taux de mutations spontané est habituellement de l’ordre de 10-6 pour la plupart des cellules. D’autres mutations affectent la synthèse de la bactérioopsine, la partie protéique de la bactériorhodopsine, ou celle du rétinal, le groupement prosthétique de cette dernière qui capte les photons. Il existe ainsi des souches dépourvues de vacuoles gazeuses ou d'autres incapables de réaliser la phototrophie.

Protocole

Beaucoup de mutations se manifestent phénotypiquement par des variations de la couleur des colonies et sont donc détectables par un examen visuel des colonies obtenues en culture sur milieu solide. Cependant, il vaut mieux utiliser une loupe binoculaire pour parcourir visuellement la boîte de culture, compte tenu de la petite taille des colonies.
Pour observer des mutations, il faut d'abord obtenir des colonies séparées sur milieu solide.
Pour cela, préparer une série de tubes à hémolyse avec 1 mL de milieu de culture liquide dans chaque.
Prélever une colonie avec une anse et la déposer dans le milieu contenu dans un des tubes en faisant tourner rapidement l’anse entre les doigts pour décrocher la colonie. Une colonie contient environ 100 millions de cellules. Fermer le tube et l’agiter vigoureusement à la main ou sur vortex pour bien mettre en suspension les cellules qui ont tendance à rester collées entre elles.
Prélever 100 µL (ou 3 gouttes) de cette suspension et les déposer dans un autre tube contenant 1 mL de milieu de culture. Fermer le tube et l’agiter vigoureusement.
Recommencer les opérations pour obtenir au total six tubes : les dilutions croissantes permettront, théoriquement, d’obtenir une centaine de cellules dans 100 µL prélevés dans le tube 6 et donc une centaine de colonies bien séparées après étalement sur le milieu solide et incubation. Mais comme le nombre de bactéries prélevé n’est jamais sûr, il est préférable de faire un étalement dans trois boîtes différentes à partir de prélèvements dans les tubes 4, 5 et 6.
Mettre ensuite les boîtes dans un sachet étanche pour empêcher l’évaporation et les placer retournées (couvercle vers le bas) à l’étuve à 37°C. À cette température, il faut environ 1 semaine pour obtenir les colonies (le temps de doublement est d’environ 6 heures et il faut environ 25 générations pour voir une colonie). À température ambiante, il faut environ 2 semaines. Pour obtenir une croissance plus rapide, on peut placer les cultures jusqu'à 42°C maximum.



Deux dilutions différentes étalées sur milieu solide pour obtenir des colonies séparées

Identification de mutants

Les bactéries de la souche sauvage, qui possèdent des vacuoles gazeuses, de la bactériorubérine (un carotènoïde membranaire) et de la bactériorhodopsine (la protéine photosensible permettant la phototrophie), forment des colonies opaques, de couleur rose clair, car la couleur de la membrane due à la bactériorhodopsine (membrane pourpre) et à la bactériorubérine (membrane rouge) est en partie masquée par la réfraction de la lumière due à la présence des vacuoles gazeuses.  Elles présentent l'aspect suivant à la loupe binoculaire :


Quelques colonies de phénotype sauvage (loupe binoculaire X 20)

Les clichés ci-dessous présentent quelques exemples de colonies présentant divers phénotypes mutants apparus spontanément dans des boîtes de culture.







Quelques colonies de phénotypes mutants (loupe binoculaire X 20)

Les colonies issues de mutants dépourvus de vacuoles gazeuses sont plus ou moins transparentes. On observe aussi des colonies légèrement pourpres lorsque la mutation affecte la synthèse de la bactériorubérine ou tirant vers l’orange lorsque c’est la synthèse de la bactériorhodopsine qui est affectée. Enfin, on observe parfois des colonies présentant des secteurs de couleurs différentes dus à l’apparition de l’une ou l’autre de ces mutations au cours de la croissance de la colonie.
En dehors de la mutation portant sur la production de vacuoles gazeuses dont la fréquence est très élevée, de l’ordre de 10-2, celles portant sur la synthèse de la bactériorubérine et de la bactériorhodopsine ont une fréquence de l’ordre de 10-4, ce qui reste très élevé pour des mutations spontanées.
Pour identifier avec plus de certitude la nature des mutations obtenues, on peut remettre une colonie en culture en milieu liquide pendant quelques jours et, d’une part, vérifier si les cellules remontent vers la surface et, d’autre part, comparer le spectre d’absorption d’une suspension de cellules sauvages avec celui d’une suspension issue d’une colonie mutante. Dans le premier cas on pourra vérifier l’absence de vacuoles gazeuses, dans le second l’absence de tel ou tel pigment.

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