Protocole
Identification des constituants chimiques d'un aliment, le lait de vache


Introduction

Le lait est le produit de la sécrétion des glandes mammaires présentes chez les femelles de mammifères. C'est l’aliment exclusif des jeunes mammifères au tout début de leur vie, pendant une période variable selon les espèces. C’est un aliment complet qui contient outre de l’eau (87 %), des sucres, des graisses, des protéines, des sels minéraux et des vitamines.

Par ses caractéristiques physico-chimiques, émulsion stable des graisses dans l'eau, suspension des micelles de caséines et solution de diverses substances (protéines solubles, lactose, ions et vitamines), le lait entier constitue un sujet d'études particulièrement riche.
Il constitue également un aliment de choix pour mettre en évidence certains constituants chimiques des aliments. De plus, comme il constitue la matière première de divers aliments (lait fermenté, yaourts, fromages) issus de sa transformation sous l’action de différents microorganismes, son étude est un bon préliminaire à celles qui peuvent être menées sur les aliments issus de transformations par des microorganismes.

Un litre de lait de vache entier contient environ 30 g de protéines, 47 g de glucides, 36 g de lipides, diverses vitamines (A, B1, B2, B9, B12, D) et 1,2 g de calcium.
Deux ensembles de protéines sont présentes dans le lait, les caséines, protéines insolubles et de nombreuses protéines solubles, comme la lactalbumine, la lactoglobuline et des immunoglobulines. 
Les glucides du lait sont représentés par le lactose, dioside réducteur. Les lipides du lait forment des globules de graisse dispersés dans le lactosérum sous forme d'émulsion.
Pour caractériser les substances dissoutes, il est nécessaire de séparer les caséines du lactosérum en les faisant précipiter.


Observation au microscope


Déposer une goutte de lait sur une lame et poser une lamelle. Observer au microscope. On observe des globules, plus ou moins nombreux selon les traitements appliqués au lait : absents du lait homogénéisé, microfiltré ou écrémé, nombreux dans le lait entier, moins nombreux dans le lait semi-écrémé. En ajoutant une goutte de rouge soudan à la préparation, la coloration rouge prise par les globules montre qu'il s'agit de graisses.

Lait demi écrémé
(sans coloration, microscope optique, X 600)

Séparation de la caséine et du lactosérum

Les caséines forment des micelles portant des charges électronégatives et se repoussent les unes les autres en constituant une suspension colloïdale. Ce sont elles qui donnent la couleur blanche du lait.
Le pHi (point isoélectrique) des caséines est de 4,6 (à pH 4,6 la charge électrique globale de la protéine est neutre). En conséquence, si la suspension de caséines est portée à pH 4,6, les micelles ne se repoussent plus et les caséines précipitent. On parle de coagulation acide. Il en résulte la formation de flocons de caséines dans le lactosérum. Le pH acide peut provenir naturellement de la fermentation du lactose présent dans le lait (fermentation lactique) ou artificiellement d'un apport d'acide dans le lait.
La coagulation des caséines peut aussi être provoquée par des enzymes, comme la présure (ou chymosine) issue de la caillette du veau. Cette enzyme découpe la caséine kappa, une sous unité qui stabilise les micelles, en deux peptides, l'un insoluble, la paracaséine kappa, l'autre soluble, le caséinomacropeptide. Cette scission déstabilise les micelles ce qui conduit à la formation d'un gel, le caillé, stabilisé par les ions calcium. C'est pourquoi, le caillage par la présure ne se produit pas en l'absence de calcium, par exemple si on a ajouté au lait un chélateur des ions calcium, comme l'EDTA.

Coagulation acide
  1. Verser du lait dans un récipient et le chauffer légèrement jusqu'à environ 40°C.
  2. Ajouter petit à petit de l'acide acétique ou du vinaigre blanc au lait chaud en mélangeant avec un agitateur.
  3. Laisser reposer le mélange jusqu'à précipitation des caséines.
  4. Filtrer l'ensemble. Récupérer séparément le filtrat qui correspond au lactosérum et le précipité de caséines présent dans le filtre.
Le lactosérum est utilisé pour mettre en évidence les substances solubles, le précipité pour caractériser les protéines.
On peut aussi déterminer la concentration en caséines dans le lait comme indiqué à la page :
http://www.didier-pol.net/2FTCAS.html

Protéines

Réaliser la réaction du biuret et la réaction xanthoprotéique sur le lactosérum et sur les caséines précipitées.

Réaction xanthoprotéique
Les protéines contenant des acides aminés dont le radical est un noyau aromatique (phénylalanine, tyrosine) réagissent avec l’acide nitrique en formant des dérivés de substitution (dérivés nitrés) jaunes.
Mélanger quelques mL de lactosérum avec de l'acide nitrique. On observe un précipité de protéines. En ajoutant quelques gouttes d’ammoniaque, une coloration orange apparaît.
Recouvrir un échantillon du précipité placé dans un tube à essai avec de l'acide nitrique. L'échantillon prend une coloration jaune.
En ajoutant quelques gouttes d’ammoniaque, une coloration orange apparaît.

Réaction du biuret
Les ions cuivre II (Cu2+) forment, en milieu basique, un complexe violet avec les substances contenant des liaisons peptidiques. La réaction permet donc de caractériser les polypeptides et les protéines.
Mélanger quelques mL de lactosérum avec une solution de soude à 20 %. Ajouter quelques gouttes de solution de sulfate de cuivre à 1 %.
Il apparaît une coloration violette.
Recouvrir doucement un échantillon du précipité placé dans un tube à essai avec une solution de soude à 20 %. Ajouter quelques gouttes de solution de sulfate de cuivre à 1 %.
Il apparaît une coloration violette.

La réaction peut se faire en utilisant à froid la liqueur de Fehling à la place du mélange soude et sulfate de cuivre. C’est pourquoi la recherche des sucres réducteurs avec la liqueur de Fehling doit être réalisée sur une solution déprotéinisée. On peut éliminer les protéines du lactosérum en le chauffant et en ajoutant du carbonate de sodium (Na2CO3) à 2 %. Les protéines précipitent et on peut les éliminer par centrifugation ou filtration.

Lactalbumine
Faire chauffer un autre échantillon de lait entier dans un bécher puis laisser refroidir jusqu’à formation de la "peau". Celle-ci est constituée par une protéine, la lactalbumine. Récupérer la "peau" dans un tube à essai pour mener les réactions caractérisant les protéines, réaction du biuret et réaction xanthoprotéique.

La recherche de protéines peut aussi se faire avec des bandelettes réactives dont il existe des modèles avec des capacités multiples de détection (protéines, nitrites, coprs cétoniques, glucose, etc.).

Sucres réducteurs

Tester le lactosérum (obligatoirement déprotéinisé) avec la liqueur de Fehling à chaud. Pour cela, mélanger dans un tube à essai quelques mL de lactosérum avec une solution de liqueur de Fehling et placer le tube au bain marie à 80°C. Un précipité rouge apparaît. On peut caractériser plus précisément le sucre réducteur par la méthode des osazones.

Ions
Chlorures

Les ions chlorures (Cl-) réagissent avec le nitrate d'argent à froid en donnant un précipité blanc de chlorure d'argent qui noircit à la lumière (principe de la photographie argentique) et se redissout dans l'ammoniaque.
Ajouter quelques gouttes de la solution de nitrate d'argent (Ag+NO3-) à quelques mL de lactosérum dans un tube à essai. La présence de chlorures se traduit par l'apparition d'un précipité blanc. Constater que le précipité noircit progressivement lorsque le tube est exposé à la lumière (réduction des ions Ag+ en argent métallique). Vérifier qu'il se dissout en présence d'ammoniaque.
Solution de nitrate d'argent (solution à conserver dans un flacon brun à l'abri de la lumière) :
5 g de nitrate d'argent dissous dans 100 mL d'eau distillée.
Ajouter quelques gouttes de nitrate d'argent au filtrat de pain.
Calcium
Les ions calcium (Ca2+) sont chélatés par l'oxalate d'ammonium aboutissant à un précipité blanc d'oxalate de calcium.
Ajouter quelques gouttes de la solution d'oxalate d'ammonium à quelques mL de lactosérum. Il se forme un précipité blanc d'oxalate de calcium.
Solution d'oxalate d'ammonium :
5 g d'oxalate d'ammonium dissous dans 100 mL d'eau distillée.

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