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ACTION DE DIVERS NEUROTRANSMETTEURS SUR LE MUSCLE DORSAL DU VER DE TERRE IN VITRO
REOUR AUX ACTIVITES PRATIQUES Molécule de nicotine


Introduction

Le programme de terminale S (programme 1995) comporte dans la partie commune un chapitre intitulé "Caractéristiques du fonctionnement des synapses" impliquant l'étude de l'organisation des synapses et des mécanismes de la transmission synaptique. Un chapitre de l'enseignement de spécialité s'intitule "Aspects biochimiques du fonctionnement nerveux".

Dans le premier cas, si l'on désire aborder ces problèmes de façon pratique, il est possible de mener une étude expérimentale du fonctionnement synaptique de façon à préciser la notion de neuromédiateur, de récepteur et de transduction d'un signal chimique. Dans le second cas, il sera possible de montrer la diversité des neuromédiateurs et de leur action et d'aborder les applications médicales et agricoles (voire militaires) en utilisant des molécules présentes dans certains médicaments (benzodiazépines) ou dans des insecticides (parathion).

Divers montages expérimentaux ont été proposés pour l'étude du fonctionnement des synapses au lycée. Nous avons choisi d'utiliser un système permettant l'étude de la synapse neuromusculaire du ver de terre en raison de la facilité d'approvisionnement de cet animal (en vente dans les magasins d'articles de pêche), de la diversité des récepteurs qu'on y trouve et du montage expérimental qui peut être réalisé avec du matériel d'ExAO. Dans ce dernier cas, différents capteurs dynamométriques ou optiques peuvent être utilisés. Le capteur dynamométrique utilisé a été décrit dans "Etude de la synapse neuromusculaire" (Biologie-géologie, 1, 1992). Il a été utilisé ici pour étudier la réponse du muscle dorsal de lombric à divers traitements par des neurotransmetteurs ou d'autres substances pharmacodynamiques. En outre, quelques suggestions d'utilisation sont proposées.


ASPECTS PRATIQUES
Dissection
La dissection du ver est menée au préalable de façon à laisser les fragments de muscle dans le milieu aéré pendant au moins une demi-heure avant mise en place.

Sectionner la partie antérieure en arrière du clitellum et l'extrémité postérieure. Découper longitudinalement la paroi du corps le long de la ligne ventrale et éliminer les organes internes à la pince. Arroser la préparation avec du liquide physiologique. Avec le dos d'une pince courbe, éliminer la chaîne nerveuse. Rincer avec du liquide physiologique et placer le fragment dans du liquide physiologique aéré avec un bulleur d'aquarium. Préparer plusieurs échantillons de façon à pouvoir en changer en cas de problème et en monter un dans la cuve du dispositif.

Montage expérimental

Mettre en route le bullage et remplir la cuve de liquide physiologique. Régler le débit à 2 ou 3 gouttes d'air par seconde.
Attacher l'échantillon et le fixer dans la cuve en faisant descendre la serre-fine inférieure en tirant sur le fil correspondant.
Régler le dispositif pour que l'échantillon soit légèrement tendu et le laisser reposer.


Muscle en place dans la cuve
Cliquer sur l'image pour l'agrandir



Particularités des muscles du ver de terre

La paroi du corps du ver de terre est limitée par un épiderme recouvert d'une fine cuticule. Elle comporte une couche de fibres musculaires circulaires recouvrant trois masses musculaires longitudinales : latéro-dorsale, latéro-ventrale et médio-ventrale.

Les muscles du ver de terre sont différents de ceux des vertébrés : ils sont formés de fibres étroites ovales ou en forme de ruban avec une striation oblique et sont donc qualifiés de muscles striés obliquement. Le raccourcissement des fibres est provoqué à la fois par le glissement relatif des myofilaments et par cisaillement : lors de la contraction, l'angle entre l'axe des myofilaments et le grand axe de la fibre musculaire augmente.

Il existe deux catégories de fibres dans les muscles du ver de terre : des fibres phasiques à contraction rapide (quelques ms) et des fibres toniques à contraction lente (quelques s).

Les fibres musculaires du ver reçoivent des terminaisons de nerfs excitateurs et de nerfs inhibiteurs. Elles sont stimulées par l'acétylcholine et l'acide glutamique et sont inhibées par le GABA.

Certaines fibres ont un potentiel d'action dû à une entrée de sodium, d'autres à une entrée de calcium.

Pour ces raisons, elles fournissent un modèle expérimental plus riche de potentialités que la synapse neuromusculaire des vertébrés.



Quelques données sur les synapses

On divise les synapses en 2 grandes catégories : les synapses rapides et les synapses lentes. Les premières possèdent des canaux ioniques activés directement par le neurotransmetteur, les secondes utilisent le système protéine G-second messager.

Les messagers chimiques les plus courants des synapses rapides sont le glutamate et l'acétylcholine (ouverture de canaux calciques, sodiques ou non spécifiques), habituellement excitateurs, et la glycine et le GABA habituellement inhibiteurs (ouverture de canaux potassiques ou chloriques).

Les messagers des synapses lentes se lient à des récepteurs couplés à une protéine G. La protéine G module le niveau d'un second messager ou le fonctionnement de canaux ioniques. Ces synapses ont pour neurotransmetteurs des neuropeptides (une quarantaine ont été identifiés à ce jour dans le SNC) et des amines biogènes (sérotonine, histamine et catécholamines). De plus, les transmetteurs des synapses rapides peuvent aussi avoir des récepteurs liés à une protéine G et peuvent donc intervenir également dans les synapses lentes. C'est donc exclusivement la nature du récepteur qui détermine le type d'action exercée par le neurotransmetteur.

La présence dans une synapse de neurotransmetteurs différents est courante de même que l'existence de récepteurs différents pour un même neurotransmetteur. Il en résulte une grande souplesse de fonctionnement et une régulation fine de l'activité des cellules cibles.

L'intérêt du modèle expérimental utilisé ici est de permettre de concrétiser une grande partie de ces données de base.

Ainsi, on montrera la diversité des neurotransmetteurs actifs in vitro et les actions excitatrice et inhibitrice. Une étude quantitative (courbe dose-réponse) de l'action d'un neurotransmetteur (glutamate ou acétylcholine) et l'utilisation d'antagonistes (curarisants) permettra de préciser la notion de récepteur.

L'utilisation d'un inhibiteur de l'acétylcholinestérase permettra la mise en évidence de cette enzyme.

On peut aussi utiliser ce modèle pour étudier le rôle des ions (milieux sans sodium et/ou milieu sans calcium, voir article cité), les canaux potassium (en les bloquant avec du TEA) ou tester d'autres substances chimiques (catécholamines, caféine, nicotine, sérotonine, insecticides organophosphorés, benzodiazépines etc.) ou des combinaisons variées de ces substances. On peut ainsi véritablement mettre les élèves en situation de recherche.

Enfin, historiquement, l'essentiel de nos connaissances sur le fonctionnement synaptique a été fourni par l'étude de la synapse neuromusculaire. Elle constitue donc un modèle de choix au point de vue pédagogique.



Principes des manipulations proposées

Pour étudier le fonctionnement de la synapse neuromusculaire du ver de terre, le fragment de muscle isolé est placé dans une cuve contenant du liquide physiologique aéré en permanence. Le fragment dont une extrémité est fixée au fond de la cuve à l'aide d'une serre-fine est relié par son autre extrémité à un levier mobile. Lorsque le muscle se contracte, il tire sur le levier dont le mouvement produit une variation de tension électrique transmise à l'interface d'acquisition. Voir montage à l'article cité.

Tout autre capteur dynamométrique peut être utilisé de la même façon.

Logiciel utilisé

Les expériences seront menées à l'aide du logiciel Régressi (MICRELEC) dont il existe des versions permettant de piloter la plupart des interfaces du commerce.


PROCEDURES

Paramétrage de l'interface

Lancer le logiciel après avoir créé un répertoire où sauvegarder les résultats.

Choisir 0 pour la tension mesurée au repos (la régler à 0.5 V) et 100 pour la tension maximale (levier à fond vers le bas).

Enregistre, Durée, Nombre de mesures : 0 (1024), Durée : 90 s.

Par défaut, le déclenchement se fait en pressant la touche espace.

Réglage du montage

Faire coulisser le tube pour obtenir un léger écartement entre la lame de cuivre et la vis de garde. Régler le potentiomètre pour obtenir 0.5 V à l'écran.


ACTION DES NEUROTRANSMETTEURS

Pour chaque expérience, déclencher la prise de mesures, injecter la substance à tester dans la cuve, rincer à l'issue de la mesure et enregistrer les données.

Pour rincer, vider le liquide physiologique et le remplacer par du liquide neuf. Attention ! Il est nécessaire de rincer rapidement la préparation après chaque mesure. Faire bien attention aux dosages.

Attendre quelques minutes et faire un nouveau rinçage. Attendre le retour du muscle à sa position initiale avant de procéder à un nouveau test.


Glutamate

C'est un des neurotransmetteurs les plus répandus. Chez les mammifères c'est le principal neurotransmetteur dans le SNC et il est également très commun chez les invertébrés.

Certaines fibres musculaires du lombric y répondent.

Utiliser du liquide physiologique sans ésérine.

Rechercher la concentration seuil après avoir fait un test avec une goutte de solution à 10 mmol.L-1 diluée au 1/10 (MM = 147 soit une solution mère à 1.47 g.L-1 ).

Sachant qu'une goutte a un volume de 30 µL et connaissant le volume de liquide dans la cuve, en déduire la concentration molaire en glutamate dans la cuve.

Faire quelques enregistrements avec des concentrations croissantes. Voir figure 1.



Acétylcholine

C'est le neurotransmetteur le plus anciennement identifié et aussi le plus répandu tant chez les vertébrés que chez les invertébrés. Il est présent dans les muscles du ver de terre où il est le principal responsable du déclenchement de la contraction.

On utilisera un liquide physiologique contenant 1 mg d'ésérine par litre pour accentuer les effets de l'acétylcholine (voir article cité).

Rechercher la concentration seuil (entre quelques nmol et 0.1 µmol dans la cuve) Commencer par un test avec une goutte de solution à 10 mmol.L-1 diluée au 1/10 soit 30 nmol dans la cuve (Solution mère d'ACh à 1.8 g/L ; MM = 181.6 ; 1 goutte = 30 µL). Faire des dilutions pour trouver la concentration seuil.
Voir figure 2.

Construire la courbe dose-réponse pour mettre en évidence l'existence du récepteur (seuil, augmentation de l'intensité de la contraction avec la concentration en ACh, saturation). A l'aide du logiciel on peut construire la courbe en coordonnées semi-logarithmique (Contraction en fonction du log de la concentration).
Voir figure 3.



Acide gamma-amino butyrique (GABA)

C'est un neurotransmetteur qui inhibe la contraction musculaire du lombric.
Tester des concentrations croissantes (tester d'abord 1 goutte de solution à 10 mmol.L-1 soit 0.1 g/100 mL ; GABA MM = 103.1) en l'absence puis en présence d'une dose-test d'acétylcholine.
Voir figure 4.


 Curarisants

On utilisera un curarisant de synthèse, le triéthiodure de gallamine ("Flaxedil").
Enregistrer l'effet de concentrations croissantes en présence d'une dose-test d'acétylcholine.
Superposer les tracés obtenus avec un tracé obtenu avec une dose-test d'ACh sans curarisant.
Voir la figure 5 :
2. Norcuron : 0.1 µg ; 3. 0.2 µg ; 4. 1µg  avec une dose test d'acétylcholine. 1, 6, 5 : concentrations croissantes d'acétylcholine sans curarisant.



Une proposition d'investigation sur le récepteur au glutamate

On connaît actuellement 5 récepteurs différents pour le glutamate dont 3 rapides (ouverture de canaux ioniques) et 2 lents (liés à une protéine G).

Parmi les 3 récepteurs rapides seul l'un d'entre eux (dit NMDA pour N-méthyl-D-aspartate, un agoniste du glutamate pour ce récepteur) ouvre un canal perméable au calcium. Or, dans les muscles dorsaux du ver, c'est l'entrée de calcium d'origine extracellulaire qui déclenche la contraction. On peut donc se poser la question de savoir si c'est ce récepteur qui est responsable du déclenchement de la contraction.

Pour essayer de déterminer s'il s'agit de ce récepteur, on peut utiliser certaines de ses propriétés :

le récepteur est obturé au repos par des ions Mg2+ qui sont déplacés lors d'une dépolarisation.

On pourra tester l'effet d'une solution sans magnésium qui devrait faciliter l'action du glutamate, l'action de concentrations croissantes de magnésium et l'effet d'un mélange acétylcholine-glutamate à comparer avec l'effet de chacun de ces neurotransmetteurs seuls. Dans chaque cas, on utilisera une concentration en neurotransmetteur à peine supérieure au seuil.

De plus, la glycine présente en concentration micromolaire augmente la réponse du récepteur NDMA au glutamate. On fera donc un test avec le glutamate en absence et en présence de glycine.

Selon les résultats obtenus, on déterminera si l'on a affaire ou non au récepteur NDMA.



Autres suggestions

Milieu sans sodium (remplacer le chlorure de sodium du milieu par du chlorure de choline en concentration 2,3 fois plus élevée).

Milieu sans calcium (ajouter 1 g d'EDTA par litre de milieu).

Blocage des canaux potassium (utiliser une solution de tétraéthylammonium à 250 mmol.L-1 dans le liquide physiologique).

Action des benzodiazépines sur le récepteur au GABA.

Action d'un insecticide organophosphoré (comparer avec l'action de l'ésérine).



Bibliographie

Guibault P. et al., Contractures cholinergiques. Biologie-Géologie, 4-1986

Pol D., Etude de la synapse neuromusculaire. Biologie-Géologie, 1-1992

Bénichou L. et al., L'activité d'un centre nerveux : le ganglion abdominal de phasme. Biologie-Géologie, 4-1993

Bellart F. et J.M. Magniez, Utilisations diverses d'un capteur de pression. Biologie-Géologie, 4-1992

Voir aussi la littérature scientifique


QUELQUES DONNEES TIREES DE LA LITTERATURE SCIENTIFIQUE SUR LE MUSCLE DORSAL DU VER DE TERRE


1) Le potentiel de membrane (ref. 1)

Le potentiel de repos est d'environ -35 mV. Il y a une activité spontanée dont la dépolarisation atteint +18 mV suivie d'une hyperpolarisation de -60 mV.

La tétrodotoxine bloque l'activité nerveuse à une concentration de 0.1 µg/ml mais n'empêche pas les décharges spontanées ou les potentiels déclenchés par stimulation intracellulaire de la fibre musculaire.

Le potentiel seuil est variable.

La repolarisation dépend du niveau du potentiel de membrane.

Quand l'activité nerveuse est exclue, la propagation de l'excitation est décrémentielle.
 
 

2) Effets des ions sur la membrane (ref. 2 et 3)

Le potentiel de repos est dû principalement aux gradients de concentration en sodium et potassium de part et d'autre de la membrane et à sa perméabilité pour ces ions.

Le flux des ions chlorure pourrait être couplé avec d'autres ions comme les anions bivalents ou être assuré par un transport actif.

Les changements de la concentration en calcium modifient la perméabilité au sodium et changent le niveau du potentiel de repos.

Au cours du potentiel d'action, la membrane devient sélectivement perméable aux ions calcium qui constituent les porteurs de charge responsables du courant entrant positif. La tétrodotoxine, en présence ou en absence de sodium, n'influence pas la production des potentiels d'action.

L'amplitude des potentiels d'action est grossièrement proportionnelle au logarithme de la concentration en calcium.

Le baryum et le strontium peuvent remplacer le calcium dans la génération des potentiels d'action.

Les ions manganèse bloquent la production des potentiels d'action par compétition avec le calcium qu'il y ait ou non du sodium dans le milieu.
 
 

3) Propriétés mécaniques (ref. 4)

La contraction du muscle dorsal présente deux composantes : une composante phasique et une composante tonique.

L'amplitude de la tension phasique est augmentée par une diminution de la concentration en sodium mais l'amplitude des potentiels d'action n'est pas modifiée.

L'excès de potassium dépolarise la membrane et diminue l'amplitude des potentiels d'action mais il augmente l'amplitude de la tension phasique jusqu'à 20 mM.

L'excès de calcium augmente l'amplitude de la tension phasique et son déficit la réduit.

L'amplitude de la tension phasique est légèrement augmentée lorsque le chlorure est remplacé par du nitrate.

L'excès de calcium est sans effet sur la tension tonique, l'excès de potassium fait disparaître la tension tonique et la diminution du sodium augmente l'amplitude et prolonge la durée de la contraction tonique.

Cette contraction ne suit pas une décharge de potentiels d'action et dure environ une minute dans les conditions normales.

La caféine et l'acétylcholine prolongent la durée de relaxation de plusieurs minutes.

Au contraire, la sérotonine bloque complètement la composante tonique sans avoir d'effet sur la composante phasique.

La caféine (12 mM) induit la contraction sans déclencher de potentiel d'action, peut être en libérant le calcium sarcoplasmique de ses sites de liaison.
 
 

4) Nerfs excitateurs et inhibiteurs. Effets des catécholamines sur la jonction neuromusculaire (ref. 5)

La membrane musculaire est innervée par des nerfs excitateurs et inhibiteurs.

Les nerfs excitateurs sont cholinergiques, les nerfs inhibiteurs sont GABAergiques.

L'acétylcholine augmente principalement la perméabilité au calcium, mais elle augmente aussi la perméabilité au potassium et au sodium.

Le GABA augmente sélectivement la perméabilité au chlorure.

Les récepteurs de l'acétylcholine sont bloqués par la d-tubocurarine et ceux au GABA par la picrotoxine.

Les catécholamines agissent sur la membrane post-synaptique par l'intermédiaire de récepteurs b à des concentrations de 10 ng à 10 µg.mL-1.

Les catécholamines agissent sur la membrane pré-synaptique par l'intermédiaire de récepteurs a .

La réponse des récepteurs a aux catécholamines augmente la libération des neurotransmetteurs des terminaisons présynaptiques alors que la réponse des b récepteurs augmente le potentiel de membrane et la résistance d'entrée de la membrane postsynaptique. Les deux types de récepteurs facilitent les mécanismes de transmission de la jonction.

5) Effets de diverses substances (ref. 6)
 

Substance Effet Concentration (par mL)
Acétylcholine Contraction 1 ng à 10 µg
Esérine Potentialise Ach 100 µg
Atropine Inhibe Ach 100 µg
Nicotinamide Contraction et inh Ach 10 µg
Tétraéthylammonium Contraction 10 µg
Succinylcholine Contraction et inh Ach 1 µg
Adrénaline (a ) Contraction 1 µg
Phentolamine (a ) Contr. inh adrénaline 10 µg
Isoprénaline (b ) Relaxation 10 µg
Dopamine (b ) Relaxation 10 µg 
Sérotonine Contraction 10 µg
Histamine  Contraction 10 µg
Xylocaïne Contraction 100 µg



Références :

1. HIDAKA T. et al (1969) Membrane properties of the somatic muscle (obliquely striated) of the earthworm. J. Exp. Biol. 50, 387-403
2. HIDAKA T. et al (1969) Effects of various ions on the resting and active membrane of the somatic muscle of the earthworm. J. Exp. Biol. 50, 405-415
3. ITO Y. et al (1970) Effects of divalent cations on spike generation in the longitudinal somatic muscle of the earthworm. J. Exp. Biol. 52, 79-94
4. HIDAKA T. et al (1969) The mechanical properties of the longitudinal muscle in the earthworm. J. Exp. Biol. 50, 431-443
5. ITO Y. et al (1971) Effects of catecholamines on the neuromuscular junction of the somatic muscle of the earthworm Pheretima communissima. J. Exp. Biol. 54, 167-186
6. ANDERSSON R. and FÄNGE R. (1967) Pharmacological receptors of an annelid Lumbricus terrestris. Archives Internationales de Physiologie et de Biochimie, 75, (3) 461-468


 
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