Fiche technique
 Préparation de protoplastes de levure


Protocole

  1. Prélever dans un tube à centrifuger 2 mL d'une suspension de levure obtenue en ensemençant la veille un milieu liquide complet
  2. Centrifuger 1 minute et jeter le surnageant.
  3. Remettre le culot en suspension dans 2 mL de la solution de pré-traitement et incuber 10 minutes à 35°C.
  4. Centrifuger brièvement et jeter le surnageant.
  5. Remettre le culot en suspension dans 2 mL de tampon au sorbitol.
  6. Centrifuger 1 minute et jeter le surnageant.
  7. Mettre le culot en suspension dans 2 mL de tampon au sorbitol et ajouter 2 mL de solution d'enzyme (lyticase) à 5 000 U.mL-1.

  8. Incuber une dizaine de minutes et contrôler l'avancement de la destruction de la paroi au microscope.


Solutions

1. Solution de pré traitement

  • Dissoudre dans 80 mL d’eau distillée :
    • EDTA : 0,74 g
    • Tris : 2,42 g
  • Ajuster le pH à 7,8.
  • Ajouter :
    • b -mercaptoéthanol : 7,8 g
    • Sorbitol : 21,8 g
  • Compléter à 100 mL
2. Solution pour protoplastes
  1. Tampon phosphate citrate pH 5,8 :

  2.  
    • Mélanger 1 volume de solution de citrate de sodium à 4,7 g.L-1 avec 1 volume de solution de dihydrogénophosphate de potassium à 10,8 g.L-1.

    • Dissoudre 21,8 g.L-1 de sorbitol dans le tampon phosphate citrate pour obtenir la solution pour protoplastes.

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Didier Pol © 2006 
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