Introduction
Le lysozyme est une enzyme présente dans divers liquides
biologiques, comme le blanc d'œuf, le mucus nasal, les larmes, le lait
ou le mucus cervical. Il est également produit par l'expression
d'un gène présent dans le génome des
bactériophages qui ont besoin que la paroi de la bactérie
hôte soit lysée pour pouvoir être
libérés et infecter de nouvelles bactéries. Il
existe également un lysozyme chez certaines plantes (latex des
genres
Ficus et
Papaya, la papaye), mais il est plus actif sur la chitine que sur les parois bactériennes.
Le lysozyme de l'œuf de poule ou de l'homme permet la destruction du peptidoglycane de la paroi
bactérienne en catalysant l'hydrolyse de la liaison osidique qui
relie la N-acétylglucosamine et l'acide
N-acétylmuramique. Le "squelette" du peptidoglycane
(appelé aussi muréine) de la paroi bactérienne est
en effet un copolymère constitué de l'enchaînement
covalent de ces deux molécules, en alternance, sur lesquelles
sont fixés des peptides qui pontent les chaînes du
polymère.
C'est la première enzyme et la seconde protéine
(après la myoglobine) dont la structure tridimensionnelle a
été établie par radiocristallographie. Les
séquences d'acides aminés et la structure tridimensionnelle des lysozymes de
différentes espèces sont proches et ressemblent
également à celles de l'alpha-lactalbumine, une
protéine présente dans le lait.
Le lysozyme est formé d'une seule chaîne protéique
de forme globulaire de 129 acides aminés comportant 4 ponts
disulfures et a une masse moléculaire de l'ordre de 14 600. Son
pH isoélectrique de 11 explique que lors d'une
électrophorèse à pH < 11, le lysozyme migre
vers la cathode.
On peut mettre en évidence l'action du lysozyme
in vitro en utilisant des bactéries sensibles à son action. La bactérie
Micrococcus
lysodeikticus
est particulièrement sensible à son action et est vendue
en poudre par les
fournisseurs de produits de laboratoire. On peut
aussi se procurer le lysozyme dans le commerce ou utiliser du lysozyme
de blanc d’œuf préparé à partir d'un œuf de poule
ou de n'importe quel œuf d'oiseau.
Préparation du lysozyme d'œuf de poule
Filtrer un blanc d’œuf de poule sur gaze et récupérer le
filtrat.
Mélanger 1 volume du filtrat avec 2 volumes d’eau distillée
sur agitateur magnétique.
Mettre l'agitateur en rotation lente et mélanger pendant environ
15 minutes.
Ajouter dans la solution, en le versant goutte à goutte, de
l’acide chlorhydrique à 1 mol.L
-1 jusqu’à apparition
d’un trouble.
Centrifuger et récupérer le surnageant ou filtrer et
récupérer le filtrat.
Le surnageant ou le filtrat peuvent être utilisés directement
pour mettre en évidence ou mesurer l'activité du lysozyme
Suivi visuel de l'action du lysozyme
Préparer une suspension de Microccocus à 0,3 mg.mL-1 à partir de la poudre de bactéries lyophilisées (une "pointe" de salpel de la poudre
dans 10 mL de tampon phosphate). Bien agiter pour que la
suspension soit bien homogène.
Placer 3 mL de la suspension dans 3 tubes à hémolyse.
Ajouter 0,2 mL de solution de lysozyme du commerce (à 2 mg.mL-1 de tampon) dans
le tube 1 ; 0,2 mL d’extrait de blanc d’œuf dans le tube 2 ; 0,2 mL d’eau
dans le tube 3.
Placer les tubes au bain marie à 37 °C et suivre visuellement
l’évolution de la turbidité qui disparaît en quelques minutes.
La réaction peut être aussi réalisée
à température ambiante, mais la vitesse de la
réaction est plus lente.
NB On peut observer au microscope une goutte
de préparation fraîche et une goutte après action de l’enzyme, colorées par le
bleu de méthylène, pour constater la disparition des bactéries dans le second cas.
Suivi par colorimétrie de l'action du lysozyme
On peut mesurer la cinétique de la
réaction par
ExAO avec un colorimètre ou un spectrophotomètre. Les
solutions à préparer sont les mêmes que
précédemment.
Diluer la suspension de Microccocus de façon à
obtenir une absorbance comprise entre 0,7 et 0,8 avec une longueur
d'onde du colorimètre de 450 nm.
Bien agiter la suspension avant chaque prélèvement pour éviter la sédimentation.
Placer 3 mL de la suspension diluée dans une cuve standard de spectrophotomètre.
Ajouter 0,2 mL de la solution d'enzyme, mélanger par retournement et placer
rapidement la cuve dans le colorimètre. Lancer
l'enregistrement.
L'absorbance diminue au fur et à mesure que les bactéries
se lysent par entrée d'eau en raison de la destruction de leur
paroi, le milieu extérieur de réaction étant moins
concentré que leur cytoplasme.
Cette réaction enzymatique peut-être
utilisée, comme toute autre, pour étudier l'action des
facteurs externes (température, pH, inhibiteurs, etc.) sur
l'action d'une enzyme ou pour établir la cinétique en
fonctionde la concentration en substrat iu en enzyme.
Solutions
- Tampon phosphate pH 6,4
100 mL de
dihydrogénophosphate de potassium 0,066 M ajusté à pH 6,4 avec KOH 1M).
- Lysozyme de blanc d'œuf
20 mg dissous dans 10 mL de tampon
Suspension de Microccocus lysodeikticus
- Suspension de Micrococcus
lysodeikticus
30 mg de bactéries lyophilisées dans 100 mL de tampon
Fournisseurs
