Fiche technique
RETOUR AU SOMMAIRE
Activité enzymatique du lysozyme

 


Introduction


Le lysozyme est une enzyme présente dans divers liquides biologiques, comme le blanc d'œuf, le mucus nasal, les larmes, le lait ou le mucus cervical. Il est également produit par l'expression d'un gène présent dans le génome des bactériophages qui ont besoin que la paroi de la bactérie hôte soit lysée pour pouvoir être libérés et infecter de nouvelles bactéries. Il existe également un lysozyme chez certaines plantes (latex des genres Ficus et Papaya, la papaye), mais il est plus actif sur la chitine que sur les parois bactériennes.
Le lysozyme de l'œuf de poule ou de l'homme permet la destruction du peptidoglycane de la paroi bactérienne en catalysant l'hydrolyse de la liaison osidique qui relie la N-acétylglucosamine et l'acide N-acétylmuramique. Le "squelette" du peptidoglycane (appelé aussi muréine) de la paroi bactérienne est en effet un copolymère constitué de l'enchaînement covalent de ces deux molécules, en alternance, sur lesquelles sont fixés des peptides qui pontent les chaînes du polymère.
C'est la première enzyme et la seconde protéine (après la myoglobine) dont la structure tridimensionnelle a été établie par radiocristallographie. Les séquences d'acides aminés et la structure tridimensionnelle des lysozymes de différentes espèces sont proches et ressemblent également à celles de l'alpha-lactalbumine, une protéine présente dans le lait.
Le lysozyme est formé d'une seule chaîne protéique de forme globulaire de 129 acides aminés comportant 4 ponts disulfures et a une masse moléculaire de l'ordre de 14 600. Son pH isoélectrique de 11 explique que lors d'une électrophorèse à pH < 11, le lysozyme migre vers la cathode.
On peut mettre en évidence l'action du lysozyme in vitro en utilisant des bactéries sensibles à son action. La bactérie Micrococcus lysodeikticus est particulièrement sensible à son action et est vendue en poudre par les fournisseurs de produits de laboratoire. On peut aussi se procurer le lysozyme dans le commerce ou utiliser du lysozyme de blanc d’œuf préparé à partir d'un œuf de poule ou de n'importe quel œuf d'oiseau.

Préparation du lysozyme d'œuf de poule

Filtrer un blanc d’œuf de poule sur gaze et récupérer le filtrat.
Mélanger 1 volume du filtrat avec 2 volumes d’eau distillée sur agitateur magnétique.
Mettre l'agitateur en rotation lente et mélanger pendant environ 15 minutes.
Ajouter dans la solution, en le versant goutte à goutte, de l’acide chlorhydrique à 1 mol.L-1 jusqu’à apparition d’un trouble.
Centrifuger et récupérer le surnageant ou filtrer et récupérer le filtrat.
Le surnageant ou le filtrat peuvent être utilisés directement pour mettre en évidence ou mesurer l'activité du lysozyme

Suivi visuel de l'action du lysozyme

Préparer une suspension de Microccocus à 0,3 mg.mL-1 à partir de la poudre de bactéries lyophilisées (une "pointe" de salpel de la poudre dans 10 mL de tampon phosphate). Bien agiter pour que la suspension soit bien homogène.
Placer 3 mL de la suspension dans 3 tubes à hémolyse.
Ajouter 0,2 mL de solution de lysozyme du commerce (à 2 mg.mL-1 de tampon) dans le tube 1 ; 0,2 mL d’extrait de blanc d’œuf dans le tube 2 ; 0,2 mL d’eau dans le tube 3. 
Placer les tubes au bain marie à 37 °C et suivre visuellement l’évolution de la turbidité qui disparaît en quelques minutes.
La réaction peut être aussi réalisée à température ambiante, mais la vitesse de la réaction est plus lente.

NB
On peut observer au microscope une goutte de préparation fraîche et une goutte après action de l’enzyme, colorées par le bleu de méthylène, pour constater la disparition des bactéries dans le second cas.

Suivi par colorimétrie de l'action du lysozyme

On peut mesurer la cinétique de la réaction par ExAO avec un colorimètre ou un spectrophotomètre. Les solutions à préparer sont les mêmes que précédemment.
Diluer la suspension de Microccocus de façon à obtenir une absorbance comprise entre 0,7 et 0,8 avec une longueur d'onde du colorimètre de 450 nm.
Bien agiter la suspension avant chaque prélèvement pour éviter la sédimentation.
Placer 3 mL de la suspension diluée dans une cuve standard de spectrophotomètre.
Ajouter 0,2 mL de la solution d'enzyme, mélanger par retournement et placer rapidement la cuve dans le colorimètre. Lancer l'enregistrement.
L'absorbance diminue au fur et à mesure que les bactéries se lysent par entrée d'eau en raison de la destruction de leur paroi, le milieu extérieur de réaction étant moins concentré que leur cytoplasme.

Cette réaction enzymatique peut-être utilisée, comme toute autre, pour étudier l'action des facteurs externes (température, pH, inhibiteurs, etc.) sur l'action d'une enzyme ou pour établir la cinétique en fonctionde la concentration en substrat iu en enzyme.

Solutions
  • Tampon phosphate pH 6,4
  • 100 mL de dihydrogénophosphate de potassium 0,066 M ajusté à pH 6,4 avec KOH 1M).
  • Lysozyme de blanc d'œuf
  • 20 mg dissous dans 10 mL de tampon Suspension de Microccocus lysodeikticus
  • Suspension de Micrococcus lysodeikticus
  • 30 mg de bactéries lyophilisées dans 100 mL de tampon

    Fournisseurs
L’Isle d’Abeau Chesnes
BP 701 38297 Saint Quentin Fallavier Cedex
Tel : 0474822800
  • SERLABO (distributeur de WORTHINGTON)
BP 82 94382
Bonneuil sur Marne Cedex
0149805000
serlabo#wanadoo.fr

RETOUR AU SOMMAIRE
TOUS DROITS RÉSERVÉS
Didier Pol © 1998-2008 

N'hésitez pas à faire connaître vos impressions, commentaires, suggestions etc
.

dpol#noos.fr
Emplacements des visiteurs de cette page