Protocole

Dosage colorimétrique du glucose


  • Principe
Il s’agit d’un dosage colorimétrique à la suite de deux réactions enzymatiques couplées. Il existe dans le commerce des kits de dosage du glucose contenant l'ensemble des produits nécessaires.
Une réaction enzymatique étroitement spécifique (glucose-oxydase) oxyde le glucose présent dans l’échantillon en acide gluconique et peroxyde d'hydrogène. Ce dernier sert de substrat à la peroxydase dans une réaction couplée conduisant à l’oxydation de l’o-dianisidine en un produit coloré. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration en glucose. 
À partir d’une courbe d'étalonnage (Absorbance = f [glucose]) établie avec des concentrations connues de glucose, on peut déterminer graphiquement la concentration en glucose dans une solution inconnue en mesurant son absorbance après traitement par le réactif. 
Dans le cas de solutions riches en protéines, un traitement préalable par l'acide trichloroacétique (5 à 10 %) peut s'avérer nécessaire pour faire précipiter les protéines. Après centrifugation du précipité on recueille le surnageant pour effectuer le dosage.
  • Matériel
Spectrophotomètre ou module PHOTOCOLOR et interface Orphy (MICRELEC), cuvettes standard, micropipette automatique 30 µL ou pipettes Pasteur, kit Glucose Trinder (SIGMA).
Le module PHOTOCOLOR réglé sur le bleu (470 nm) est connecté à l'entrée EA4 (prise B) sur la façade de l'interface GTS ou GTI. 
Les interfaces Orphy portables reconnaissent directement les capteurs.
Voie : une voie, EA4
Etalonnage : 100 mV = 100 % de transmission (T : Transmittance).
Absorbance = log 100/T
Acquisition au clavier en fonction de la concentration.  

Module Photocolor et interface Orphy GTS
 
Spectrophotomètre interfacé avec l'ordinateur
  • Protocole

    • Préparation des réactifs
Dissoudre une capsule d’enzymes (peroxydase-glucose oxydase) dans 100 mL d'eau. 
Ajouter 1,6 mL de solution d'o-dianisidine. 
Le réactif est prêt à l'emploi et peut être conservé quelques jours au réfrigérateur.
NB L'évolution des techniques peut conduire à une modification du protocole de préparation des réactifs. Si c'est le cas, suivre les indications fournies avec le kit.
Préparer une solution de glucose (0,1 g/100 mL soit 5,5 mmol/L).
    • Courbe d'étalonnage
Par dilution de la solution mère à 5,5 mmol/L, préparer des solutions de glucose diluées au 1/2, au 1/4, au 1/8, au 1/16 et au 1/32. Placer 3 mL de réactif dans six cuves de colorimètre et ajouter une goutte de pipette Pasteur (ou 30 µL avec une pipette de précision) de chaque solution de glucose dans les cuves ainsi qu’une goutte d’eau dans une cuve témoin.
Mettre les cuves au bain-marie pendant 30 min.
Mesurer l’absorbance de chaque cuve puis construire la courbe A = f ([glucose]). C'est la courbe d'étalonnage.
    • Mesure

Placer une goutte de milieu à tester dans une cuve contenant 3 mL de réactif et la placer au bain-marie pendant 30 min. Faire des dilutions le cas échéant si la coloration se révèle trop intense.

Lire l'absorbance de la solution et déterminer la concentration en glucose graphiquement : c’est l’abscisse du point de la courbe ayant l’absorbance relevée. 

Dans l'exemple ci-contre, la concentration mesurée est de 117 nmol.L-1.


Détermination graphique de la concentration en glucose
(concentrations molaires des échantillons de 30 µL introduits dans la cuve)
  • Fournisseurs
  • Kit pour le dosage colorimétrique du glucose
    (Glucose Trinder)
    SIGMA
    L'Isle d'Abeau Chesnes BP 701
    38297 Saint Quentin Fallavier

Module PHOTOCOLOR et interface Orphy

MICRELEC
1 place Abel Leblanc
77120 Coulommiers
01 64 65 04 50

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