Travaux pratiques

CONVERSION DE L’ENERGIE DES METABOLITES


On sait que les levures sont des organismes aérobies facultatifs. Cela signifie que, selon les conditions de milieu, elles obtiennent leur énergie soit par respiration (lorsque de l'oxygène moléculaire est disponible : aérobiose) soit par fermentation (lorsqu'il n'y a pas d'oxygène moléculaire : anaérobiose). Dans les deux cas, l'énergie produite par la dégradation des substrats énergétiques est utilisée pour faire la synthèse d’adénosine triphosphate (ATP). L'ATP est qualifiée de petite monnaie des échanges énergétiques car l'énergie libérée par son hydrolyse est pratiquement la seule forme d’énergie capable d’alimenter les diverses activités cellulaires.

Nous avons constaté lors de l'étude du métabolisme énergétique de la levure les faits suivants :

  • La respiration et la fermentation sont des phénomènes cellulaires.
  • L'énergie nécessaire aux activités cellulaires provient de la dégradation de molécules organiques.
  • La vitesse de consommation du glucose est plus rapide au cours de la fermentation alcoolique qu'au cours de la respiration pour un même nombre de cellules produites.
  • Pour une quantité égale de glucose consommé, l'énergie libérée par la respiration est très supérieure à celle libérée par la fermentation.
Problème : on cherche à déterminer la quantité d'ATP présente dans des cellules de levure placées en aérobiose ou en anaérobiose pour la mettre en relation avec la vitesse de consommation du glucose lors de la respiration et de la fermentation.

Objectifs : extraire l'ATP d'un nombre égal de cellules placées en aérobiose et en anaérobiose et en réaliser le dosage pour déterminer la concentration cellulaire en ATP.

Principe du dosage

On dose l'ATP par bioluminescence. Chez la luciole (ou "ver luisant", insecte émettant de la lumière), la lumière est produite au cours d'une réaction enzymatique. Dans les cellules de l'abdomen de l'insecte constituant la lanterne, un substrat appelé luciférine réagit simultanément avec l'oxygène moléculaire et l'ATP sous l'action d'une enzyme appelée luciférase selon l'équation bilan ci-dessous.

Luciférase
                        ATP + luciférine + O2   ®  oxyluciférine + AMP + PP + CO2 + lumière

Lorsque l'ATP est le facteur limitant de la réaction, la quantité de lumière émise est proportionnelle à la concentration en ATP. Aussi, lorsque l'on mélange in vitro de la luciférine, du dioxygène et de la luciférase, le mélange produit de la lumière dès que l'on y ajoute de l'ATP. On construit ainsi une droite d'étalonnage en mesurant à l'aide d'un luminomètre la lumière produite avec des concentrations connues d'ATP. On extrait ensuite l'ATP d'un nombre connu de cellules et on mesure la lumière produite lorsqu’il est mélangé avec le réactif (mélange luciférine, O2, luciférase). À partir de la droite d'étalonnage, on déduit la concentration en ATP de l'échantillon. Connaissant le nombre de cellules dans l'échantillon, on en déduit la concentration en ATP par cellule.

Protocole

Extraction et dosage : Voir fiche technique.

  1. Extraire l'ATP des deux échantillons de levures (aérobiose et anaérobiose) et le doser en suivant le protocole indiqué.
  2. À partir de la droite d'étalonnage, déterminer graphiquement la concentration en ATP de l'échantillon.
  3. Déterminer la concentration en cellules de l'échantillon à l'aide d'une lame à numération et d'un microscope.
  4. En déduire la concentration en ATP par cellule de levure.
  5. Reporter chaque résultat individuel dans un tableau collectif et faire la moyenne, d'une part pour les cellules en aérobiose et, d'autre part, pour les cellules en anaérobiose.
Questions
  1. Établir la liste des activités cellulaires de la levure consommatrices d'énergie en donnant des exemples précis.
  2. Calculer la concentration en ATP par cellule, en aérobiose et en anaérobiose et en déduire le nombre de molécules disponibles dans les cellules dans les deux cas.
  3. Comparer la concentration en ATP dans les cellules en aérobiose et en anaérobiose.
  4. Mettre en relation les résultats obtenus avec les mesures de consommation de glucose lors de la respiration et de la fermentation des levures.
  5. Rédiger une conclusion.

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