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Règles de travail en asepsie pour la culture de microorganismes
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- Les paillasses sont nettoyées
avec un chiffon imbibé d'eau de Javel préalablement à l'installation du poste
de travail. L'eau de Javel est préparée extemporanément à partir d'un berlingot
du commerce à raison de 250 mL d'eau de Javel du commerce dans 750 mL d'eau.
- Les postes de travail sont
organisés autour d'un bec Bunsen ou d'une lampe à alcool (technique
mise au point par L. Pasteur). La flamme doit rester allumée en
permanence : de
cette façon, les microorganismes de l'atmosphère sont entraînés vers le
haut
par le courant d'air chaud et ne risquent pas de se déposer sur le
matériel
utilisé. La flamme est également utilisée pour stériliser les
instruments.
- Tout le matériel est disposé
autour de la flamme dans un cercle d'une vingtaine de cm de rayon.
- Avant toute manipulation, il est
conseillé de se laver soigneusement les mains en utilisant une brosse à ongles
puis de les passer à l'alcool à 70° et de les laisser sécher. Au cours des
manipulations, il faut éviter de parler et de faire des mouvements brusques
provoquant des courants d'air pour ne pas projeter de microorganismes.
- Aprés les manipulations :
décontaminer tout le matériel en l'immergeant dans l'eau de Javel pendant 1
heure.
- De nombreuses manipulations
nécessitent le prélèvement de microorganismes à partir de cultures sur boîte de Petri ou en
milieu liquide. L'instrument le mieux adapté est l'ensemenceur (synonymes :
anse, öse) formé d'un manche portant un fil métallique (platine ou
nickel-chrome) dont l'extrêmité est fermée en boucle (voir figure ci-contre). Le volume
de liquide contenu dans la boucle est connu et dépend du type d'ensemenceur.
- Avant chaque prélèvement, le fil
est stérilisé par passage dans la flamme et doit être utilisé après
refroidissement pour ne pas "cuire" les microorganismes.
Les diverses techniques
d'isolement de colonies, notamment par étalement en stries, sont décrites dans une autre fiche technique :
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Principaux matériels nécessaires en microbiologie
Bec Bunsen, öse, supports pour tubes, vortex
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Il est également possible
d'utiliser du matériel à usage unique préstérilisé.
- Stérilisation des
milieux et du matériel
Typiquement, la verrerie, les
milieux et les divers matériels utilisés doivent être stérilisés à
l'autoclave à 120°C
pendant 20 minutes mais des solutions existent au cas où manquerait cet
appareil dans le laboratoire.
- Autocuiseur ("Cocotte-minute")
- Mettre de l'eau au fond de
l’autocuiseur sur 1 à 2 cm
de hauteur. Disposer le matériel à stériliser dans le panier pour cuisson à la
vapeur. Envelopper le petit matériel (tubes, pipettes, boîtes de Pétri) dans du
papier d'aluminium.
- Les flacons ne doivent pas être
hermétiquement bouchés : poser simplement le bouchon sans le visser pour ceux
munis d’un pas de vis. Pour les autres, faire un capuchon en papier
d'aluminium.
- Fermer la cocotte, chauffer
jusqu’à mise en rotation de la soupape et compter vingt minutes après la mise
en rotation de la soupape.
- Le matériel stérilisé peut être
stocké dans un placard et les milieux peuvent être stérilisés à l'avance et
conservés hermétiquement fermés au réfrigérateur.
- Au moment de leur utilisation,
les milieux solides sont refondus au four à microondes en surveillant pour
éviter les projections.
- Si un milieu solide conservé au
réfrigérateur a besoin d'être supplémenté, l'addition des suppléments doit être
faite après la refonte. Il en est de même pour l'addition d'antibiotiques.
- Tous les milieux peuvent être
stérilisés par la chaleur humide (autoclave ou autocuiseur) mais lorsque le
milieu doit être supplémenté en diverses substances (vitamines, acides aminés,
antibiotiques), il est plus simple de stériliser les petits volumes de
suppléments par passage à travers un filtre millipore (pores de 0,22 µm). Le
filtrat peut être conservé dans un tube stérile au réfrigérateur.
- En plus de son utilisation pour
refondre les milieux solides conservés au froid, le four à microondes peut
également être utilisé pour la stérilisation de la verrerie et des milieux.
- La verrerie doit être placée
pendant une quinzaine de minutes au four à microondes réglé à la puissance
maximale. Les milieux sont aussi passés à la puissance maximale pendant une
quinzaine de minutes. Pour cela, les flacons doivent être d'un volume très supérieur
à celui des milieux à stériliser et ne doivent pas être bouchés. Préparer des
bouchons de coton cardé et les placer au four en même temps que les flacons.
- Une surveillance doit être
exercée pendant tout le processus de façon à ne pas laisser se projeter le
milieu en raison d'une ébullition trop violente : dès que le liquide commence à
bouillonner, baisser la puissance pour éviter les projections. Placer les
bouchons de coton sur les flacons dès l'ouverture du four.
- Ne pas oublier que les métaux ne
doivent pas être mis dans un four à micro-ondes. En conséquence, il ne faut pas
utiliser de papier d'aluminium.
- Les stérilisateurs pour biberon
constituent une solution simple d'utilisation et très bon marché pour résoudre
le problème de la stérilisation. On en trouve dans toutes les grandes surfaces.
- La plupart des matériels existent
sous une forme préstérilisée à usage unique. C'est le cas des ensemenceurs et
des étaleurs, des boîtes de Pétri, des pipettes, de l’eau et des tubes de
microbiologie etc., c’est à dire des principaux éléments utilisés pour cultiver
les microorganismes.
- Quoique de prix de revient
sensiblement plus élevé que le matériel réutilisable, ils sont beaucoup plus
pratiques.
- On peut également utiliser des
cure-dent stériles, plats, pour réaliser les transferts de colonies.
- Il existe
aussi des milieux stériles, prêts à l'emploi, soit sous forme déshydratée, soit
précoulés en boîte de Pétri.
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