Travaux pratiques

BIOSYNTHESE ET DESTINEE DES PROTEINES


I- Etude histologique du pancréas

1) Observer la préparation au faible grossissement. Repérer les types cellulaires correspondant à la double structure du pancréas (endocrine et exocrine).

2) Compléter le schéma fourni par des légendes complètes et indiquer la localisation de la coloration observée dans les cellules acineuses.

3) Expliquer en quelques lignes en quoi diffèrent le pôle basal et le pôle apical de ces cellules.

II- Mise en évidence de protéines exportées et de protéines non exportées

Ce travail sera réalisé sur la levure, Saccharomyces cerevisiae. Ce champignon unicellulaire est capable d’utiliser les diosides saccharose et maltose. Toutefois, pour pouvoir servir de source d’énergie, les diosides doivent être hydrolysés car seuls les oses participent au métabolisme énergétique. Ceci suppose que les levures synthétisent les protéines enzymatiques correspondantes appelées saccharase et maltase capables d’hydrolyser respectivement le saccharose et le maltose. Toutefois, l’hydrolyse de chaque dioside peut se produire soit dans le milieu extérieur si l’enzyme correspondante est exportée à l’extérieur de la cellule soit à l’intérieur des cellules si l’enzyme correspondante n’est pas sécrétée. Dans ce dernier cas, ceci suppose que la cellule dispose d’un transporteur membranaire permettant la pénétration du sucre correspondant. On recherchera donc expérimentalement si les levures exportent ou non l’une et/ou l’autre de ces deux enzymes.

Principe de l’expérience

Les levures étant capables de vivre en milieu liquide, on recherchera la présence des deux enzymes, d’une part dans le milieu de culture et, d’autre part, dans un extrait des cellules après avoir séparé les cellules du milieu de culture par centrifugation

Protocole

1- Préparer 3 tubes et les marquer T (témoin), S (saccharose), M (maltose) et y verser respectivement 5 mL d’eau, 5 mL de solution de saccharose et 5 mL de solution de maltose.

2- Ajouter dans chaque tube 5 mL du milieu de culture et incuber à 35°C pendant 10 min.

3- Rechercher la présence éventuelle de glucose dans chaque tube à l'aide de bandelettes réactives spécifiques du glucose : prélever une goutte du milieu avec une pipette Pasteur et la déposer sur la zone réactive de la bandelette. Attendre 10 s, essorer la bandelette avec un essuie-tout et lire le résultat.

Compte rendu

Coller chaque bandelette sur votre feuille de compte rendu en indiquant en dessous le substrat testé (T, S et M), le résultat (présence ou absence de glucose) et les autres informations nécessaires.

4) Expliquer en quoi un test positif (présence de glucose) permet d’affirmer que la levure sécrète l’enzyme correspondante.

5) En fonction du résultat obtenu en déduire si la saccharase et/ou la maltase sont sécrétées par la levure.

6) Si c’est le cas, écrire la ou les équations-bilan des réactions correspondantes.

Si une ou les deux enzymes ne sont pas exportées, il doit être néanmoins possible de la détecter à l’intérieur des cellules puisque les levures sont capables d’utiliser le saccharose et le maltose. Pour cela, il faut extraire le contenu des cellules de levures et rechercher si l’extrait présente l’activité enzymatique correspondante.

Protocole

1- Broyer le culot de centrifugation avec une pincée de sable dans un mortier d’abord à sec puis après avoir ajouté 25 mL de tampon phosphate pH 5.8. Continuer à broyer quelques minutes et centrifuger pour séparer les débris cellulaires du surnageant.

2- Tester l’activité enzymatique du surnageant en utilisant 3 tubes par la méthode indiquée au protocole précédent.

Coller les bandelettes avec les informations nécessaires sur la feuille de compte rendu.

7) Ecrire la ou les équation-bilan correspondantes en fonction de vos résultats.

8) Donner une conclusion générale qui montre si le problème posé au II- a été résolu par les expériences.

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