RETOUR AU SOMMAIRE
Retour au sommaire de la biologie amusante

LES EMPREINTES DIGITALES DES MOLECULES


Jusqu'au début de ce siècle, les biologistes étaient confrontés à un problème jugé insoluble : le nombre de substances chimiques différentes présentes dans les cellules vivantes est immense. On sait aujourd'hui qu'il y a, en général, plusieurs milliers de types de molécules différentes dans une seule cellule. Même si, à l'époque, on ne pensait pas qu'elles puissent être si nombreuses, il était décourageant d'essayer d'isoler une substance chimique donnée dans un mélange aussi complexe. De plus, si on savait purifier plus ou moins correctement des substances particulièrement abondantes, il en allait tout autrement de la plupart des molécules biologiques présentes en quantités infimes dans les cellules. On en était donc réduit à caractériser les molécules présentes dans un mélange, soit par une propriété chimique, au risque de confondre ainsi deux molécules différentes partageant une caractéristique chimique commune, soit à tester l'activité biologique d'extraits grossièrement purifiés pour mettre en évidence, indirectement, la présence ou l'absence de telle ou telle molécule.

Par ailleurs, ce type d'analyse ne pouvait convenir pour les molécules essentielles des êtres vivants comme les protéines ou les acides nucléiques : étant donné leur grande taille, ces macromolécules sont particulièrement fragiles et sont souvent endommagées lors de leur extraction.

C'est ainsi que l'ADN, découvert dés 1869 par Miescher, ne révéla sa composition chimique que vers les années 30.

De la même façon, lorsque Sumner, en 1917, décida d'isoler une enzyme, il fut traité de fou. Il y parvint pourtant en 1926 car il utilisa un matériel particulièrement riche en enzyme, la germination de Soja (voir amylase). Toutefois, s'il parvint à la cristalliser, il ne put en établir la constitution chimique faute d'une technique d'analyse appropriée. C'est Frederick Sanger qui y parvint le premier en étudiant l'insuline, une hormone qui règle le taux de glucose dans le sang. Bien que son professeur lui ait interdit de se consacrer à cette recherche pendant ses heures de travail, car il considérait la tâche comme impossible, Sanger s'entêta et parvint au but en 1954. On savait déjà que les protéinessont constituées d'une longue chaîne formée de petites unités, les acides aminés (dont il n'existe que 20 types différents), liés les uns aux autres. Sanger parvint à établir la séquence exacte des 51 acides aminés qui composent l'insuline et reçut pour cela le prix Nobel de chimie en 1958. Une des raisons de son sucés fut l'utilisation, encore peu répandue, d'une technique de séparation des molécules d'un mélange, la chromatographie sur papier.

L'invention de la chromatographie avait pourtant déjà 50 ans : c'est un biochimiste russe, Mikhaïl Semenovitch Tswett (1872-1919) qui la mit au point en 1906. Ce chercheur étudiant les pigments des plantes montra en 1900 qu'il existe 2 types de chlorophylles différentes qui se distinguent par certaines de leurs propriétés. Séparer et purifier deux molécules presque identiques sur le plan chimique était alors impossible. Tswett eut l'idée géniale de dissoudre ses extraits de feuilles contenant les pigments dans du pétrole et de faire couler cette solution à travers une colonne contenant une poudre. Dans un premier temps il utilisa du sel ou du sucre, puis du carbonate de calcium et de l'alumine, plus efficaces. Dans ces conditions, les pigments différents descendent dans la colonne entraînés par le pétrole à des vitesses très légèrement différentes. En effet, leur capacité à se lier soit au pétrole, soit aux grains de la poudre est elle-même légèrement différente en raison de leur constitution chimique qui n'est pas parfaitement identique. Chaque pigment finit par se fixer aux grains à une hauteur déterminée dans la colonne quand la force d'entraînement exercée par le pétrole (la phase mobile) devient inférieure à la force d'attraction (adsorption) exercée par les grains (la phase fixe). Il se forme alors une bande colorée constituée par l'accumulation des molécules d'un seul pigment à un même niveau dans la colonne. Il montra ainsi qu'il existe 6 pigments différents dans les feuilles : 2 pigments verts, les chlorophylles a et b, des pigments jaunes, les xanthophylles et des pigments oranges ou rouges, les carotènes. Il inventa alors le nom de chromatographie pour qualifier sa technique qui ne suscita guère d'intérêt à l'époque.

C'est Richard Willstäter (1872-1942), biochimiste allemand et Richard Kuhn (1900-1967), biochimiste autrichien, qui devaient retrouver sa méthode quelques années plus tard et la perfectionner. Ils l'utilisèrent également pour des travaux sur les pigments végétaux, mais aussi pour des études sur les vitamines. Ces travaux devaient leur valoir le prix Nobel de chimie : en 1915 à Willstäter, connu également pour avoir établi la structure chimique et réalisé la synthèse de la cocaïne, puis, en 1938, à Kuhn. Deux chercheurs britanniques devaient développer cette technique en utilisant un support beaucoup plus simple, le papier : en 1941, A.J.P.Martin et R.Synge eurent l'idée d'utiliser ce support pour séparer les acides aminés d'un mélange. En déposant dans le coin d'une feuille de papier une goutte du mélange et en laissant circuler le long de la feuille un solvant approprié, ils arrivèrent à séparer plusieurs acides aminés dans le sens de la hauteur. En reprenant la feuille de papier et en faisant migrer un autre solvant perpendiculairement à la première dimension, ils arrivèrent à séparer les 20 acides aminés qui constituent les protéines. Dés lors, la caractérisation de n'importe quel acide aminé put être réalisée en mesurant sa distance de migration dans des conditions définies. En coupant une macromolécule en ses constituants avec des enzymes, puis en soumettant la solution à une chromatographie, on obtient une empreinte caractéristique des constituants de la molécule, aussi particulière à une molécule que le sont les empreintes digitales pour un homme. Bien que le nom de chromatographie ne se justifie plus, car ces substances sont incolores et qu'il faut les révéler par un réactif qui les colore, il a été néanmoins conservé. La technique fut utilisée pour analyser toutes sortes de mélanges et y caractériser telles ou telles substances. De plus, il devint possible d'obtenir une molécule biologique avec une pureté inégalée. C'est ainsi que Chargaff et Davidson montrèrent en 1949 que dans tous les ADN on constate toujours l'égalité des bases thymine et adénine d'une part et guanine et cytosine d'autre part. Le développement de la chromatographie valut à Martin et Synge le prix Nobel de chimie en 1952. Martin ne devait pas s'arrêter en si bon chemin puisqu'en 1953 il mit au point la chromatographie en phase gazeuse qui permet l'analyse des composés volatils. C'est notamment ainsi que l'on peut actuellement détecter dans l'urine des athlètes des produits dopants à des concentrations indétectables par toute autre méthode.



EXPERIENCE

ANALYSONS QUELQUES SUBSTANCES PAR CHROMATOGRAPHIE

Pour faciliter notre travail, nous utiliserons des substances colorées que nous n'aurons donc pas besoin de révéler.

Matériel

Un flacon en verre de 15 à 20 cm de haut, un petit morceau de fil métallique, un compte-gouttes, papier buvard (blanc de préférence), encres de différentes couleurs, colorants alimentaires, feutres à pointe fine...ou toute substance colorée dont vous voulez déterminer les constituants.

Comment procéder ?

Découper dans le buvard ou le papier filtre des bandes de longueur légèrement inférieure à la hauteur du flacon et larges de 2 à 3 cm. Faire un trou dans le couvercle de façon à y passer le fil métallique qui servira à suspendre la bande dans le flacon. Mettre de l'eau dans le flacon sur une hauteur de 1 à 2 cm. Placer la bande sur une surface propre et tirer un trait de crayon à papier (jamais d'encre) à 3 cm de son extrémité, perpendiculairement à sa grande longueur. Au milieu de ce trait, faire un point avec le stylo ou le feutre de 3 à 5 mm de diamètre ou déposer une goutte la plus petite possible en effleurant le papier avec la pointe du compte-gouttes préalablement trempé dans le liquide à analyser. Placer la bande dans le flacon, après l'avoir accrochée au fil métallique, de manière à ce que le bout de la bande touche la surface de l'eau mais que la tache d'échantillon soit au moins à 1 cm au dessus de l'eau en réglant la hauteur de la bande avec le fil métallique. Laisser l'eau monter par capillarité le long de la bande : c'est le développement du chromatogramme, c'est à dire la séparation des constituants du mélange. Quand l'eau atteint le haut de la bande, arrêter le développement et laisser sécher.

Résultat

Vous pourrez constater que la plupart des substances colorées artificielles (encres, colorants alimentaires par exemple) résultent d'un savant mélange de divers pigments.


 



Amusez-vous bien !

RETOUR AU SOMMAIRE
TOUS DROITS RESERVES
© 1996-2000 D. Pol
dpol#noos.fr
Emplacements des visiteurs de cette page

N'hésitez pas à faire connaître vos impressions, commentaires, suggestions etc